基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的二仙湯“異病同治”乳腺增生和圍絕經(jīng)期綜合征的作用機制

遲皓南，孫小慧，楊 毅△

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250014；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，山東 濟南 250011

乳腺增生（hyperplasia of mammary glands，HMG）是一種由于乳腺組織不斷增生與復(fù)舊導(dǎo)致的良性病變，好發(fā)于中青年女性，臨床常表現(xiàn)為乳房疼痛，反復(fù)發(fā)作，易形成乳房腫塊［1-2］。目前治療HMG 的方法多樣，如中西醫(yī)結(jié)合治療、物理治療等［3-5］，但治療效果不一，甚則出現(xiàn)胃腸道不適等不良反應(yīng)。圍絕經(jīng)期綜合征（perimenopausal syndrome，PMS）是由于中老年女性卵巢生理功能減退，性激素分泌紊亂，骨密度降低等原因出現(xiàn)的一類臨床癥候群，發(fā)病風(fēng)險較高［6］，可伴有潮熱盜汗、睡眠障礙、情緒異常等癥狀，嚴重者可導(dǎo)致心血管及泌尿系統(tǒng)疾病［7］，影響患者身心健康與生活質(zhì)量。相關(guān)指南指出，激素治療能夠緩解PMS［8］，但部分患者會引發(fā)陰道流血等婦科疾病［9］。

二仙湯出自《中醫(yī)方劑臨床手冊》，是張伯訥教授創(chuàng)制的一首經(jīng)驗方。該方由仙茅、淫羊藿、巴戟天、當歸、知母、黃柏組成，具有陰陽雙補，調(diào)理沖任之功。相關(guān)研究［10-12］顯示，二仙湯治療HMG與PMS 均在于調(diào)節(jié)體內(nèi)雌、孕激素水平及調(diào)控信號傳導(dǎo)通路異常等，其中仙茅、淫羊藿、巴戟天等單味中藥能分泌卵巢顆粒細胞促進雌二醇，進而改善人體內(nèi)分泌環(huán)境。然而二仙湯組方有效成分較多，涉及的靶點通路復(fù)雜，具體分子作用機制尚未闡明，且單用傳統(tǒng)藥理學(xué)難以系統(tǒng)分析。因此，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究二仙湯“異病同治”HMG及PMS的分子機制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 二仙湯活性成分及靶點篩選運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）進行數(shù)據(jù)挖掘，以“仙茅”“淫羊藿”“知母”“巴戟天”“當歸”“黃柏”為關(guān)鍵詞，經(jīng)過對既往中藥有效成分的藥物代謝動力學(xué)研究結(jié)果［13］，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 和藥物類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18篩選二仙湯有效活性成分及潛在作用靶點，然后使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org），以“人”為屬性設(shè)定，進行靶點整合和基因規(guī)范化處理。

1.2 疾病靶點預(yù)測在人類基因數(shù)據(jù)庫（the human gene database，GeneCards）（https：//www.genecards.org）與在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）（http：//omim.org）中輸入疾病關(guān)鍵詞“hyperplasia of mammary glands”和“perimenopausal syndrome”，剔除重復(fù)靶點后，確定乳腺增生和圍絕經(jīng)期綜合征的疾病靶點。

1.3 藥物與疾病交集靶點預(yù)測與構(gòu)建利用Venn圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），獲得二仙湯中的活性成分與HMG及PMS的重疊靶基因。

1.4 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將二仙湯中活性成分、藥物與疾病的交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點代表藥物、成分、疾病及靶點，邊代表藥物、成分、靶點、疾病間的相互作用關(guān)系。

1.5 PPl 及核心靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用STRING（http：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建藥物與疾病的交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)；借助Cytoscape 3.7.2軟件，以≥Degree 平均值篩選二仙湯治療HMG 和PMS的核心靶點。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析利用核心靶基因?qū)牖蚬δ茏⑨寯?shù)據(jù)庫（the database for annotation visualization and integrated discovery，DAVID）對藥物與疾病的交集靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，以P＜0.05 為篩選標準，分別選取前10 條GO 功能及KEGG 通路，制成柱狀圖進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 二仙湯活性成分及靶點預(yù)測共得到二仙湯有效活性成分104 個，其中仙茅7 個，淫羊藿23個，知母15個，巴戟天20個，當歸2個，黃柏37個，刪除重復(fù)活性成分得到二仙湯活性成分對應(yīng)靶點147個。見表1。

表1 二仙湯活性成分基本信息

2.2 HMG 與PMS 靶點預(yù)測在GeneCards 和OMIM疾病數(shù)據(jù)庫以“hyperplasia of mammary glands”和“perimenopausal syndrome”為關(guān)鍵詞檢索，得到疾病靶點HMG 4153 個、PMS 155 個。將二仙湯靶點與兩種疾病靶點進行映射，得到二仙湯“異病同治”HMG和PMS的29個靶點。見圖1。

圖1 二仙湯與乳腺增生和圍絕經(jīng)期綜合征Venn圖

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)圖中藍色節(jié)點代表二仙湯中藥物名稱，紅色節(jié)點代表疾病名稱，黃色節(jié)點代表藥物活性成分，綠色節(jié)點代表靶點。其中，β-谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）、槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）等節(jié)點的自由度分別為198、176、170、106，提示以上活性成分可能是二仙湯治療HMG 和PMS 的關(guān)鍵活性成分。見圖2。

2.4 PPl網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將二仙湯與HMG和PMS的交集靶點導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫平臺，設(shè)置屬性為“人”，構(gòu)建靶點間的蛋白互作關(guān)系圖，圖中共有29 個節(jié)點，174 條邊，平均節(jié)點值為12。利用Cytoscape 3.7.2 軟件，以Degree 值≥12 為篩選標準，其中IL-6、VEGFA、TNF、TP53、ESR1、CAT、IL-1β等靶點的自由度較高，說明以上靶點可能是二仙湯作用于HMG和PMS的核心靶點。見圖3。

圖3 二仙湯治療HMG與PMS的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 交集靶點的GO功能與KEGG代謝通路富集分析共篩選得到生物過程（biological process，BP）121條，主要涉及DNA模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、缺氧反應(yīng)等生物過程；細胞組分（cellular component，CC）15 條，主要涉及胞外間隙、胞外區(qū)、質(zhì)膜等；分子功能（molecular function，MF）26 條，主要涉及類固醇結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇激素受體活性等分子功能。分別選取前10 條制成柱狀圖。通過篩選得到KEGG 通路20條，主要涉及TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、癌癥信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。見圖4—5。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG富集分析

3 討論

運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討二仙湯“異病同治”HMG 和PMS 的分子機制，二仙湯“異病同治”HMG 和PMS的活性化合物104個，預(yù)測得到靶點147個。

通過“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)可以看出，β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚等活性成分可能是二仙湯治療HMG 和PMS 的關(guān)鍵活性成分。研究顯示，β-谷甾醇可以通過誘導(dǎo)ERα和Erβ兩種受體發(fā)揮雌激素樣作用［14］，改善機體內(nèi)分泌環(huán)境，其中Erα和Erβ受體可促進和抑制乳腺組織增殖［10］，二者作用協(xié)同保護乳腺組織。此外，β-谷甾醇還能通過刺激卵巢顆粒細胞分泌雌二醇［15］，進而增強成骨作用及抑制破骨作用，提高骨密度［16］，改善PMS。槲皮素作為天然黃酮類中的一員，具有與雌激素相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可發(fā)揮雌激素樣作用［17］，同時也可調(diào)節(jié)雌激素代謝途徑，直接調(diào)節(jié)乳腺癌T47D-β細胞的Erβ受體表達，影響ERα/ERβ比值，抑制細胞異常增殖［18］，防止乳腺組織癌變。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能通過改善雌激素水平進而修復(fù)卵巢功能，促進卵泡發(fā)育與顆粒細胞增殖，增加雌激素分泌［19］，從而緩解PMS 癥狀。二仙湯中的活性成分可通過發(fā)揮雌激素樣作用與調(diào)控雌激素代謝從而達到“異病同治”HMG和PMS的目的。

通過STRING在線數(shù)據(jù)庫平臺分析得出，IL-6、VEGFA、TNF、TP53、ESR1、CAT、IL-1β等靶點可能為二仙湯治療HMG 和PMS 的關(guān)鍵靶點。IL-6 作為細胞因子家族的核心成員，在機體免疫、炎癥、細胞生成等方面起重要作用［20-22］。其中，在正常乳腺組織中，IL-6 通過與IL-6R 結(jié)合激活I(lǐng)L-6/STAT3信號通路，并通過與細胞核中相對應(yīng)的靶基因發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)芳香酶活性，促進雌二醇表達［23］，調(diào)節(jié)機體內(nèi)分泌環(huán)境，在防治HMG 方面起重要作用。同時，TNF、IL-6 等炎癥細胞因子可抑制成骨細胞活性，增加破骨細胞活性［24］，因此抑制炎癥因子的激活可以減少骨質(zhì)流失，改善由PMS 導(dǎo)致的骨密度降低，降低骨折風(fēng)險。VEGFA 是VEGF 家族中的一員，在血管生成過程中，該基因是對內(nèi)皮細胞有特異性的唯一因子，參與了多種生理及病理過程的血管生成［25-26］。圍絕經(jīng)期女性體內(nèi)激素水平變化與細胞凋亡關(guān)系密切，該階段女性體內(nèi)卵巢粒細胞凋亡導(dǎo)致卵泡停止發(fā)育，雌激素減少。研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA 高表達參與了卵泡發(fā)育等生殖過程［27］，可產(chǎn)生雌激素。同時，雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）可與槲皮素結(jié)合發(fā)揮雌激素樣保護作用，影響PMS 的發(fā)展進程，提示二仙湯可通過多靶點“異病同治”HMG和PMS。

GO 富集分析發(fā)現(xiàn)二仙湯治療HMG 和PMS 的生物過程主要涉及DNA 模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、缺氧反應(yīng)、生物合成過程的正向調(diào)節(jié)、類固醇結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇激素受體活性等。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集在TNF信號通路、NOD 樣體信號通路、HIF-1 信號通路、癌癥信號通路、PI3K-Akt 信號通路等信號通路上，說明二仙湯主要通過調(diào)控信號通路參與治療HMG 和PMS。研究表明，PI3K-Akt信號通路通過影響其下游靶蛋白而促進乳腺細胞增殖及抑制凋亡等［28］，同時也參與骨形成和骨重建過程［29-30］。PI3K-Akt 可通過ErbB 信號通路激活，促進神經(jīng)干細胞分化，防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病［31］，緩解由PMS 造成的睡眠障礙、情緒失常等癥狀。研究發(fā)現(xiàn)［32］，HIF-1 通路參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理演變，抑制HIF-1 可改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松嚴重程度。HIF-1 信號通路對缺氧導(dǎo)致的血管生成發(fā)揮重要作用［33］，可增強乳腺組織抗氧化能力，提高機體免疫功能，改善增生病理組織，具有抗乳腺增生作用。因此，二仙湯中的活性成分可能通過PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路等參與治療HMG和PMS。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析二仙湯“異病同治”HMG和PMS的分子機制，發(fā)現(xiàn)有147 種可直接或間接影響HMG 和PMS 的有效成分以及可治療HMG 和PMS 的29 個核心靶點。推斷PI3K-Akt 信號通路、HIF-1 信號通路可能是治療HMG 和PMS 的關(guān)鍵和主要途徑。這些數(shù)據(jù)可為二仙湯的臨床應(yīng)用及進一步開發(fā)提供一定理論依據(jù)，但具體機制仍需結(jié)合體內(nèi)實驗進一步驗證。