基于網(wǎng)絡藥理學方法探討黃芪治療骨骼肌減少癥的作用機制*

張 濤，葉 斌，嚴雋陶，馬書杰

1 上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200437；2 上海市第三康復醫(yī)院，上海 200436； 3 上海市第二康復醫(yī)院，上海 201900

骨骼肌減少癥又稱肌少癥、肌肉減少癥，是一種以肌肉質(zhì)量和肌肉功能喪失為特征的年齡相關性疾病，其病因可分為繼發(fā)性及原發(fā)性。繼發(fā)性骨骼肌減少多由肌肉失用、營養(yǎng)不良、內(nèi)分泌失調(diào)等因素引起，而原發(fā)性骨骼肌減少癥屬增齡性疾病。研究顯示正常人骨骼肌質(zhì)量從40 歲后便開始下降，到80 歲時質(zhì)量大約下降40%［1］，與年齡增長導致神經(jīng)功能下降、生長激素分泌改變、炎癥通路激活、胰島素抵抗等引起的肌肉蛋白合成與蛋白水解失衡有關［2-3］。作為一種常見于老年人的慢性病，骨骼肌減少癥會增加患病老年人群的跌倒、骨折以及住院風險［4-6］。由于目前尚無專門針對骨骼肌減少癥的西醫(yī)治療方法，中醫(yī)藥在治療骨骼肌減少癥中的作用逐漸凸顯。

骨骼肌減少癥屬中醫(yī)學“痿證”“虛勞”等范疇。氣血虧虛，脾胃運化無力，水谷精微不能濡養(yǎng)肌肉是該病病因。黃芪味甘，性微溫，入脾、肺經(jīng)，具有補氣升陽、固表止汗、脫毒生肌、利水消腫等功效，在治療骨骼肌減少癥中發(fā)揮重要作用［7］。已有臨床試驗證實，黃芪可增加老年人肌肉質(zhì)量、力量及活動能力［8］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪在抗氧化、增強免疫以及抗衰老方面具有良好效果［9-10］，其主要生物活性成分黃芪多糖對骨骼肌成肌細胞具有增殖作用［11］。

由于黃芪活性成分多、作用靶點復雜，因此僅通過臨床試驗和基礎研究并不能闡明黃芪治療骨骼肌減少癥的關鍵靶點及其作用機制。故本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法，通過構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”的拓撲網(wǎng)絡結構，分析黃芪治療骨骼肌減少癥的有效靶點、作用信號通路和生物學功能，探究黃芪治療骨骼肌減少癥的作用機制。

1 研究方法

1.1 黃芪有效活性成分篩選及作用靶點預測使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）篩選黃芪的活性成分，以藥物的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug like，DL）≥0.18為篩選條件，將篩選出的活性成分與其潛在作用靶點進行配對，并通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白轉換為基因名稱，刪除重復項及無法轉換的靶點，得到黃芪主要活性成分作用靶點。

1.2 骨骼肌減少癥靶點預測以“Sarcopenia”為搜索詞，在美國國立生物中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）GEO 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）搜索已公布的人類骨骼肌減少癥的基因芯片數(shù)據(jù)集。本研究使用GSE1428 數(shù)據(jù)集［12］，該數(shù)據(jù)集基于GPL96 平臺［HG-U133A］Affymetrix Human Genome U133A Array，包括10位年輕受試者（19～25歲）和12位年齡較大受試者（70～80歲）的股外側肌的整體基因表達譜。

將GSE1428 數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)分組后使用GEO自帶的GEO 2R 分析工具進行分析，利用R 語言limma［13］工具包輸出同時滿足|log2 fold change（log2FC）|＞1 且P＜0.05 的差異表達基因，然后根據(jù)相應平臺文件對應的R語言hgu133a.db包將探針名轉化為基因名。以“Sarcopenia”為搜索詞，在人類基因數(shù)據(jù)庫（the human gene database，GeneCards，https：//www.genecards.org）中檢索骨骼肌減少癥的相關靶點，與GEO 數(shù)據(jù)庫獲取的基因進行合并，刪除重復項。

1.3 構建共同靶點的蛋白互作網(wǎng)絡采用STRING在線數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org），將疾病與藥物交集靶點進行蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡（proteinprotein interactions，PPI）分析。使用Cytoscape中“Network analyzer”插件對PPI 網(wǎng)絡進行拓撲學分析，得到節(jié)點的度值（Degree），根據(jù)度值大小確定核心靶點。

1.4 “藥物-活性成分-靶點-疾病調(diào)控”網(wǎng)絡構建使用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”調(diào)控網(wǎng)絡。應用“Network analyzer”插件分析網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，得出上述網(wǎng)絡中節(jié)點的度值，根據(jù)度值大小確定重要活性成分及靶點。

1.5 活性成分與靶點蛋白的分子對接驗證從PDB 數(shù)據(jù)庫下載關鍵靶點蛋白3D 結構，從TCMSP平臺下載主要活性成分MOL2文件，然后使用PyMOL軟件對關鍵靶點蛋白進行去水、加氫等操作，通過AutoDockTools 1.5.6 及AutoDock Vina 軟 件 進行分子對接，記錄結合能。

1.6 基因本體論（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov）對核心靶點進行GO分析，探尋黃芪治療骨骼肌減少癥的生物功能；通過KEGG 通路富集分析，探究黃芪治療骨骼肌減少癥的主要信號通路，以P＜0.05為篩選標準。

2 結果

2.1 黃芪有效活性成分篩選及作用靶點預測從TCMSP共檢索獲得黃芪活性成分87個，按照OB≥30%與DL≥0.18 進行篩選后，最終獲得黃芪有效活性成分17個。見表1。

表1 黃芪有效活性成分

2.2 骨骼肌減少癥的潛在作用靶點預測通過R 語言3.6.2 軟件將GSE1428 數(shù)據(jù)集進行歸一化處理，利用limma 包對骨骼肌減少癥和正常肌肉組織數(shù)據(jù)進行差異表達分析，最終得到1001 個差異基因；從GeneCards 中共檢索出骨骼肌減少癥作用靶點192 個；剔除重復靶點共獲得骨骼肌減少癥相關基因靶點1057個。

2.3 黃芪治療骨骼肌減少癥潛在作用靶點預測從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中查找黃芪有效活性成分對應的靶點蛋白并剔除重復、無效靶點，得到黃芪有效活性成分的作用靶點155個。GEO差異基因分析及GeneCards 數(shù)據(jù)庫中獲得骨骼肌減少癥的相關靶點1057個，使用在線Venny平臺獲得黃芪與骨骼肌減少癥的藥物-疾病交集靶點共36個。見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點韋恩圖

2.4 藥物-活性成分-靶點-疾病調(diào)控網(wǎng)絡構建網(wǎng)絡中節(jié)點大小與顏色深淺代表該節(jié)點度值的大小，度值越大節(jié)點越大、顏色越深。該網(wǎng)絡中度值排名前5位的化合物分別是HQ2［槲皮素（quercetin）］、HQ14［華良姜素（jaranol）］、HQ12［聯(lián)苯雙酯（bifendate）］、HQ8［7-O-甲基莫諾苷（7-O-methylisomucronulatol）］、HQ6［異鼠李素（isorhamnetin）］。見圖2。

圖2 藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡

2.5 PPl網(wǎng)絡構建及網(wǎng)絡拓撲分析通過STRING數(shù)據(jù)庫將36 個交集靶點以最低要求互動得分（minimum required interaction score）0.7 為篩選參數(shù)，共得到198對蛋白互作關系，涉及35個蛋白靶點。采用Cytoscape 軟件構建“活性成分-靶點”PPI 網(wǎng)絡，通過“Network Analyzer”工具分析網(wǎng)絡中節(jié)點度值，根據(jù)度值排序確定核心靶點。度值≥10 的蛋白基因靶點在PPI 網(wǎng)絡中起關鍵作用，可以認為是黃芪有效成分調(diào)控骨骼肌減少癥的關鍵基因。見表2、圖3。

圖3 藥物-疾病靶點基因PPI網(wǎng)絡

表2 藥物-疾病核心靶點基因

2.6 活性成分與靶點蛋白的分子對接驗證選擇度值排名前5 的活性成分與靶點基因進行分子對接驗證。使用AutoDock 軟件進行結合能力預測，其中構象越穩(wěn)定則結合能越低，通常結合能＜0 kcal/mol 提示分子間具有結合活性，結合能＜-5.0 kcal/mol提示分子間具有較強的結合活性［14］。將5種活性成分與5個靶蛋白對接后發(fā)現(xiàn)槲皮素、華良姜素、異鼠李素、7-O-methylisomucronulatol及聯(lián)苯雙酯與Akt1、TP53、VEGFA、TNF及ESR1均有較好的結合能力。使用PyMOL 軟件對靶點蛋白與成分對接的最佳構象進行可視化分析，直觀展示其構象關系，以MOL000098為例。見表3、圖4。

圖4 MOL000098與關鍵基因分子對接模式圖

表3 活性成分與關鍵基因分子對接結果

2.7 GO富集分析將36個交集靶點基因上傳到David 在線數(shù)據(jù)庫進行GO 富集分析，得到具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）的GO富集條目共164條，其中生物學進程（biological process，BP）條目125條，細胞組分（cellular component，CC）條目11 條，分子功能（molecular function，MF）條目28 條。結果顯示靶點基因主要參與的BP 包括炎癥反應（inflammatory response）、凋亡過程的正調(diào)控（positive regulation of apoptotic process）、細胞對缺氧的反應（cellular response to hypoxia）、內(nèi)皮細胞增殖的正向調(diào)控（positive regulation of endothelial cell proliferation）、細胞衰老（cell aging）等；靶點基因主要參與的CC 包括細胞核（nucleus）、細胞質(zhì)膜（plasma membrane）、細胞溶質(zhì)（cytosol）、核漿（nucleoplasm）、細 胞 外 區(qū) 域（extracellular region）等；參與的MF 主要包括蛋白質(zhì)結合（protein binding）、蛋白質(zhì)均二聚活性（protein homodimerization activity）、轉運活性（transporter activity）、過氧化物酶體增殖物激活受體結合（peroxisome proliferator activated receptor binding）、肌動蛋白結合（actin binding）、生長因子活性（growth factor activity）、蛋白磷酸酶抑制劑活性（protein phosphatase inhibitor activity）等。圖5 展示了每個模塊P值最小的前20 個條目，P值越小其顏色越偏向紅色，反之顏色偏向藍色；點的大小表示富集的基因數(shù)。

圖5 GO富集分析氣泡圖（前20條）

2.8 KEGG 富集分析KEGG 分析顯示靶點基因共富集了72 條相關通路，主要涉及癌癥、腫瘤壞死因子、低氧誘導因子1、細胞凋亡、Toll 樣受體等信號通路，這些通路與免疫炎癥反應、骨代謝、血管生成和免疫調(diào)節(jié)相關。P值排序最小的20個條目見圖6；黃芪治療骨骼肌減少癥的相關信號通路及對應靶點基因關系見圖7。

圖6 KEGG富集分析氣泡圖（前20條）

圖7 藥物-疾病相關信號通路及對應靶點基因關系

3 討論

本研究通過構建及分析藥物-活性成分-靶點-疾病調(diào)控網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)，黃芪治療骨骼肌減少癥的有效活性成分包括槲皮素、華良姜素、聯(lián)苯雙酯、異鼠李素、三萜皂苷、山柰酚、毛蕊異黃酮等13種，這些化合物大多具有抗免疫炎癥、抗氧化應激以及改善代謝紊亂作用。槲皮素是一種黃酮類化合物，具有抗氧化及抗炎作用。研究表明槲皮素可調(diào)控炎癥介質(zhì)TNF-α，減弱其對蛋白質(zhì)的降解作用，延緩年齡相關骨骼肌減少癥［15］。盡管目前有關聯(lián)苯雙酯治療骨骼肌減少癥的基礎研究較少，但有大量研究證實聯(lián)苯雙酯可以降低TNF-α表達，具有調(diào)節(jié)免疫炎癥和抗氧化作用［16］。三萜皂苷被證明可通過抑制NF-κB 通路減少促炎介質(zhì)如一氧化碳、TNF-α、白細胞介素1β等［17］；異鼠李素與三萜皂苷作用相似［18］，可抑制活性氧介導的缺氧誘導因子1α積累［19］；毛蕊異黃酮具有抗自噬、抗凋亡和抗炎作用，可上調(diào)B細胞淋巴瘤因子2樣蛋白表達，同時抑制TNF-α表達［20］。

本研究確定了藥物-疾病的交集靶點包括AKT1、P53、VEGFA、TNF、ESR1 等，GO 分析結果顯示這些靶點基因主要涉及炎癥反應、細胞的增殖與凋亡、氧化應激、細胞衰老等生物學過程，并影響蛋白質(zhì)結合、蛋白質(zhì)均二聚活性、轉運活性、過氧化物酶體增殖物激活受體結合、肌動蛋白結合、生長因子活性、蛋白磷酸酶抑制劑活性等分子功能。盡管凋亡會引起肌細胞的氧化損傷和肌纖維萎縮，但這一生物學過程在降解受損炎性細胞、緩解組織損傷、恢復組織完整性等方面發(fā)揮積極作用［21］。研究顯示Akt1的激活通過調(diào)控p53正向凋亡調(diào)控因子影響下游凋亡信號傳導，導致肌細胞凋亡和骨骼肌減少癥的發(fā)生［22］。除在癌癥中發(fā)揮作用外，p53 在細胞代謝、胰島素抵抗、免疫炎癥、骨骼肌分化和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中也具有重要調(diào)控作用［23-24］，并且?guī)缀跛袑е鹿趋兰p少癥的通路均與p53基因的活性相關，但說法不一。Fox等發(fā)現(xiàn)成年小鼠的骨骼肌纖維中p53 表達可引起肌萎縮，提示p53 可能是誘導年齡相關骨骼肌減少的關鍵基因［25］。另有研究表明p53 有助于維持骨骼肌線粒體功能，可能在預防骨骼肌萎縮中發(fā)揮作用［26］。以上表明黃芪可能通過雙向良性調(diào)節(jié)來延緩骨骼肌減少癥的發(fā)生。

微循環(huán)在肌肉可塑性、修復和再生中發(fā)揮重要作用。VEGFA 作為維持血管形態(tài)和完整性的重要基因，可促進內(nèi)皮細胞增生、遷移，并使血管通透性增加［27］。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 表達的降低可引起老年人毛細血管稀疏和血管生成減弱，阻斷VEGF會影響骨骼肌微血管生成，改變局部微循環(huán)，阻礙肌肉的修復與再生［28］。此外，VEGF 還可與Flk-1和Flt-1 受體結合直接刺激肌衛(wèi)星細胞遷移并抑制肌衛(wèi)星細胞凋亡，起維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)和促進骨骼肌再生的作用［29］。促炎細胞因子TNF-α 與骨骼肌減少癥的相關機制研究主要圍繞泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，它可通過增加atrogin-1 和MuRF1 表達，激活泛素-蛋白酶體介導的肌纖維溶解［30］。TNFα還通過調(diào)控血管內(nèi)皮細胞黏附因子引起蛋白代謝失衡［31］，或通過激活κB 激酶抑制劑誘發(fā)胰島素抵抗［32］等機制加速骨骼肌萎縮。同時，骨骼肌減少癥的發(fā)展還與衰老引起的性腺功能減退及性激素分泌減少有關［33］。本研究證實黃芪活性成分可通過調(diào)控ESR、AR等性激素受體發(fā)揮治療作用。

黃芪調(diào)控的另一個關鍵疾病靶點基因為CDKN1A，CDKN1A受抗癌藥物、DNA損傷、p53和p73、氧化應激、細胞因子和生長因子等多種因素和途徑調(diào)控［34］。研究證實，CDKN1A 蛋白在老年動物肌細胞中表達增加，可降低肌衛(wèi)星細胞增殖率［35］。作為JAK/STAT 信號通路成員，JUN 在骨骼肌減少癥中呈高表達，其作用機制可能與負調(diào)控骨骼肌細胞增殖有關［36］。作為細胞外基質(zhì)降解的重要蛋白，MMP1、MMP3 在差異分析中呈低表達。研究發(fā)現(xiàn)，增齡引起的細胞外基質(zhì)降解減慢和膠原過度沉積也是骨骼肌減少癥發(fā)生的重要機制，而通過上調(diào)MMP 表達，可恢復細胞外基質(zhì)的正常降解速率，改善骨骼肌質(zhì)量和功能［37］。

KEGG 富集分析結果顯示靶點基因富集最多的信號通路為癌癥通路，此通路是HIF-1、VEGF、凋亡、p53、JAK-STAT、MAPK、TGF-β等信號通路的交匯通路，可調(diào)控骨骼肌增殖、氧化應激及免疫炎癥、分化、轉化、細胞凋亡等多種生物過程，在骨骼肌減少癥的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用。HIF-1信號通路活性的調(diào)控機制受活性氧和氮氧化物等多種因素影響，在骨骼肌細胞凋亡和自噬過程中同樣發(fā)揮重要作用［38］。通過激活調(diào)節(jié)葡萄糖轉運和糖酵解基因，HIF-1 還可提高肌細胞對缺氧的適應性，并增強VEGF及其受體表達，以應對氧供應減少［39］。研究表明，在暴露于嚴重的低壓低氧前10 min抑制HIF-1轉錄因子，可減輕骨骼肌損傷［40］。

綜上所述，本研究結果證實黃芪通過“多靶點”“多途徑”調(diào)控細胞衰老和凋亡過程，改善局部微循環(huán)，降低細胞外基質(zhì)降解速度，減輕慢性炎癥及氧化應激損傷來延緩骨骼肌萎縮，這可為今后黃芪治療骨骼肌減少癥的基礎研究及臨床治療提供新思路。