薏苡仁油聯合5-FU 對結腸癌HCT-116 細胞株增殖、凋亡的影響*

王 韜，費建東，聶雙發，李 磊

河北北方學院附屬第一醫院胃腸外科，河北 張家口 075000

結腸癌屬于臨床發病率較高的惡性腫瘤之一，其發病和人口老齡化、飲食結構與生活習慣改變等有相關性，對人類健康造成了嚴重威脅［1］。現階段，臨床通常采用早期根除手術后聯合化療治療結腸癌，常見化療藥物包括奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）等［2］。但研究顯示，術后單獨采用化療藥物治療結腸癌對提高患者術后生存率效果不理想，故研究聯合用藥方式迫在眉睫［3］。薏苡仁油是從中藥薏苡仁中提取的一種抗腫瘤物質，體外實驗顯示，薏苡仁油能有效抑制乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌以及腸癌等癌細胞生長，誘導細胞凋亡，但其發揮誘導細胞凋亡作用的具體機制尚未完全闡明［4-5］。因此，本研究探討薏苡仁油聯合5-FU 對結腸癌HCT-116 細胞增殖、凋亡的影響以及作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑人結腸癌HCT-116 細胞株（西南醫科大學附屬醫院醫學實驗中心）；注射用薏苡仁油（浙江康萊特藥業公司，批號：1503163-1，規格：400 g/瓶）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號：16000-044）；RPMI-1640 培養基（美國Gibco 公司）；5-FU（上海旭東海普藥業有限公司，批號：FA160305）；碘化丙啶（美國Sigma 公司，批號：MKBP1360V）；Annexin-V/PI 凋亡試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：1030D057）；四甲基偶氮唑鹽［（methyl thiazolyl tetrazdium，MTT），美國Sigma公司，批號：M2128］。

1.2 細胞培養將細胞置于含鼠源單克隆抗體、羊抗鼠IgG-HRP 及10%胎牛血清的1640 培養基中，在37 ℃，含有5%二氧化碳的細胞培養箱中培養，選擇對數生長期細胞完成實驗。

1.3 MTT法測定細胞增殖情況實驗分組：薏苡仁油10、20、40 μL/mL組及5-FU組（50 μg/mL）、薏苡仁油10 μL/mL+5-FU 組、薏苡仁油20 μL/mL+5-FU組、薏苡仁油40 μL/mL+5-FU 組、空白對照組。將細胞按照每孔2×104標準在96 孔培養板中接種，待細胞貼壁后，加入以上各種藥物，空白對照組加入等體積生理鹽水，每組均設6 個副孔；培養24、48及72 h，避光條件下每孔分別加入20 μL MTT，孵育4 h 后去除MTT 與培養基，每孔分別加入150 μL DMSO，震蕩處理5 min，測定各孔吸光度值（OD）。重復實驗3次，取平均值。

細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD 值/空白對照組OD值）×100%

1.4 流式細胞術測定細胞凋亡情況48 h 培養后收集各組HCT-116 細胞，離心半徑10 cm，1000 r/min 離心5 min，去除上清液，采用磷酸緩沖液漂洗2 次，加入碘化丙錠、AnnexinV-FITC 染液，混勻后在4 ℃環境下避光染色15 min，上機檢測熒光強度。

1.5 RT-PCR 法測定生存蛋白（Survivin）mRNA 表達水平收集給藥前后結腸癌細胞，提取細胞總RNA，嚴格按照試劑盒說明書進行擴增、逆轉錄操作，選擇PCR產物10進行電泳，在紫外燈下攝影。

1.6 統計學方法采用SPSS 18.0 軟件分析數據，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人結腸癌HCT-116 細胞增殖抑制率薏苡仁油、5-FU、5-FU+薏苡仁油均對人結腸癌HCT-116細胞增殖產生一定抑制作用，且薏苡仁油濃度越高，作用時間越長，細胞增殖抑制率越高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與薏苡仁油組、5-FU 組相比，5-FU+薏苡仁油組細胞增殖抑制率更高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組人結腸癌HCT-116細胞增殖抑制率（±s）

注：#表示與5-FU+薏苡仁油組比較，P＜0.05

組別細胞增殖抑制率（%）濃度（μL/mL）10 20 40 50 50+10 50+20 50+40薏苡仁油組5-FU組5-FU+薏苡仁油組72 h 43.58±4.19#50.44±4.49#61.63±3.26#54.28±2.63#69.65±2.30 78.96±2.89 83.36±3.98 24 h 28.66±1.78#34.26±1.35#38.68±2.09#37.36±2.61#48.48±0.82 54.12±2.15 59.98±2.36 48 h 40.66±3.69#43.36±2.49#52.77±1.59#46.77±4.15#63.45±2.15 71.15±2.78 80.12±2.98

2.2 人結腸癌HCT-116 細胞凋亡率薏苡仁油組、5-FU 組、5-FU+薏苡仁油組細胞凋亡率均高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；薏苡仁油濃度越高，細胞凋亡率越高，差異有統計學意義（P＜0.05）；5-FU+薏苡仁油組細胞凋亡率高于5-FU組及薏苡仁油組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組人結腸癌HCT-116細胞凋亡率及Survivin mRNA表達（±s）

表2 各組人結腸癌HCT-116細胞凋亡率及Survivin mRNA表達（±s）

注：#表示與空白對照組比較，P＜0.05；*表示與5-FU+薏苡仁油組比較，P＜0.05；-表示等體積生理鹽水

組別空白對照組薏苡仁油組5-FU組5-FU+薏苡仁油組Survivin mRNA表達1.353±0.277*0.813±0.072#*0.762±0.625#*0.743±0.222#*1.721±0.328#*0.805±0.162#0.726±0.123#0.701±0.108#濃度（μL/mL）-10 20 40 50 50+10 50+20 50+40細胞凋亡率（%）4.01±0.25*20.32±1.52#*41.35±1.63#*50.98±1.56#*34.15±1.05#*69.51±2.56#72.56±2.65#79.98±2.88#

2.3 HCT-116 細胞中Survivin mRNA 表達與空白對照組比較，不同濃度薏苡仁油干預48 h 后Survivin mRNA 表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；5-FU 組Survivin mRNA 表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；5-FU+薏苡仁油組Survivin mRNA 表達較5-FU 組降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

結腸癌為全球范圍內發病率較高的惡性腫瘤之一，常見治療方式包括靶向治療、放化療、手術等［6］。蒽環類藥物與5-FU為臨床治療結腸癌的常見化療藥物，但單獨用藥效果不理想，易產生耐藥性［7-10］。本研究在5-FU 基礎上聯合薏苡仁油治療結腸癌，以達高效、低毒目的。薏苡仁具有清熱排膿、舒筋除痹、健脾去濕、利水消腫功效［11］。薏苡仁油為薏苡仁的活性成分，能干擾腫瘤細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡［12-13］。同時，薏苡仁油還能抑制血管形成及血管內皮生長因子蛋白陽性表達，進而避免腫瘤復發、轉移［14］；能調節T 淋巴細胞活性、細胞因子水平，提高機體免疫功能；薏苡仁酯還能在體外直接抑制結腸癌細胞增殖，誘導其凋亡［15］。

本研究結果顯示，薏苡仁油、5-FU、5-FU+薏苡仁油均對人結腸癌HCT-116 細胞增殖產生一定抑制作用，且薏苡仁油濃度越高，作用時間越長，細胞增殖抑制率越高。提示薏苡仁油不僅能抑制HCT-116 細胞生長，還能提高5-FU 對HCT-116 細胞活性、增殖的抑制作用，并具有時間-劑量依賴性。唐翠萍等［16］研究顯示，薏苡仁能增強紫杉醇抑制人乳腺癌細胞增殖作用。趙娜等［17］研究發現，在吉非替尼基礎上聯合薏苡仁能促進人肺腺癌細胞A549 細胞凋亡。以上結果均與本研究結果相似，進一步證明薏苡仁能增強化療效果，抑制腫瘤細胞增殖。同時，薏苡仁油濃度越高，細胞凋亡率越高；5-FU+薏苡仁油組細胞凋亡率高于5-FU組及薏苡仁油組（P＜0.05），提示5-FU 與薏苡仁油聯合治療結腸癌利于發揮藥物協同作用，進一步增強對腫瘤細胞的殺傷作用，其作用機制可能與Survivin mRNA表達密切相關。Survivin為一種凋亡抑制蛋白，與腫瘤細胞化療抵抗密切相關［18］。研究顯示，Survivin 高表達是腫瘤細胞逃避凋亡，進而產生耐藥性的重要原因［19-21］。抑制腫瘤細胞中Survivin表達，不僅能誘導腫瘤細胞凋亡，同時還能進一步增強化療效果。本研究中不同濃度薏苡仁油干預HCT-116 細胞48 h 后Survivin mRNA表達降低（P＜0.05），提示薏苡仁油能在一定程度上抑制Survivin表達。但與空白對照組相比，5-FU組Survivin mRNA 表達升高（P＜0.05），提示5-FU可能對HCT-116細胞中Survivin表達具有誘導作用，這也可能是HCT-116細胞對5-FU產生耐藥性的原因之一。但5-FU+薏苡仁油組Survivin mRNA表達較5-FU 組降低（P＜0.05），提示薏苡仁油不僅能促使HCT-116 細胞中Survivin mRNA 表達降低，同時也能促使5-FU誘導的Survivin mRNA高表達降低，推測這可能是薏苡仁油提高HCT-116 細胞對5-FU敏感性的重要機制。

綜上所述，薏苡仁油能抑制結腸癌HCT-116細胞增殖，誘導細胞凋亡，與5-FU 聯用能發揮藥物協同作用，其作用機制可能與Survivin mRNA表達下調相關，但需進一步深入探討。