基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的大黃蟄蟲丸治療結(jié)直腸癌作用機制研究

柏小輝 蔣 麗 吳 震 陶 琦 潘萌莎

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）目前已成為一種普遍的惡性腫瘤，全球發(fā)病率不斷上升，CRC的發(fā)展過程具有多階段、多步驟的特點[1]，早期CRC可通過手術(shù)方法治療，發(fā)展到中晚期后則需依賴于化療、放療提高其五年生存率。雖然靶向藥物在治療CRC方面有優(yōu)勢，但對于自然或獲得性耐藥，其生存效益并不十分理想。根據(jù)《金匱要略》闡述及臨床經(jīng)驗，大黃蟄蟲丸（DHZCP）主要用于治療因五勞七傷而致淤血阻滯，臨床以體形消瘦、兩目黯黑、肌膚甲錯、腹?jié)M不食為特征。組方由熟大黃、蟄蟲（炒）、水蛭（制）、虻蟲（去翅足，炒）、蠐螬（炒）、桃仁、干漆（煅）、黃芩、白芍、炒苦杏仁、地黃和甘草12 味中藥組成，具有“掃毒攻堅，蕩滌積垢，推陳出新，蟲動其疲，通以去閉，活血化疲。”之功效。對于CRC中后期出現(xiàn)的腹痛、消瘦、貧血、乏力、腸梗阻等癥狀有較好的針對性[2]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為目前中藥學(xué)科的前端研究，通過揭示疾病、靶蛋白與藥效組分之間的內(nèi)在聯(lián)系，在分子層面探索藥效組分的作用機制，這與具有多組分、多途徑、多靶點特性的中藥復(fù)方擁有天然的兼容性，從而為中醫(yī)向循證醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)變提供了新思路[3]。DHZCP治療CRC確有療效，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)致使其臨床應(yīng)用受限。本文擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探尋DHZCP所含化學(xué)組分與CRC相關(guān)靶點的結(jié)合效應(yīng)，進而從系統(tǒng)生物學(xué)整體水平闡釋其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制，為DHZCP應(yīng)用于CRC臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 DHZCP化學(xué)組分?jǐn)?shù)據(jù)庫的構(gòu)建 使用傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP和中國中藥整合數(shù)據(jù)庫TCMID收集DHZCP中每味中藥的所有化學(xué)組分，并結(jié)合文獻進行數(shù)據(jù)整理。

1.2 有效化學(xué)成分的篩選 本研究的建構(gòu)模型為ADME（藥物吸收、分布、代謝、排泄）模型，借助TCMSP平臺系統(tǒng)來獲取化學(xué)組分的口服利用度（OB）和類藥性（DL）信息，篩選條件為OB≥30%及DL≥0.18，以此獲得活性組分的作用靶點。運用UniProt數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一檢索蛋白靶點ID及基因名。

1.3 DHZCP抗CRC核心靶點確定 基于DrugBank及聯(lián)合化療方案[4]，確定包括5-Fu、左旋亞葉酸、替吡嘧啶、瑞格菲尼、卡培他濱、伊立替康、曲氟尿苷、雷替曲塞、紫杉醇在內(nèi)的CRC化療藥物9個，通過PharmMapperServer數(shù)據(jù)庫預(yù)測其作用靶點。基于GeneCards數(shù)據(jù)庫驗證陽性藥預(yù)測靶點與CRC的關(guān)系。將上述陽性藥與DHZCP組分導(dǎo)入SwissTargetPredicton與PharmMapper數(shù)據(jù)庫搜索作用靶點，合并去重后獲得陽性藥作用靶點和DHZCP組分的作用靶點。此外，在CTD數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫中，以關(guān)鍵詞“Colorectal Cancer”進行搜索。

1.4 網(wǎng)絡(luò)模型拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析 使用NetworkAnalyzer插件計算網(wǎng)絡(luò)模型拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，靶點蛋白作為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點，度中心度（DC）、接近中心度（CC）、中介中心度（BC）作為與靶點蛋白相關(guān)聯(lián)的主要參數(shù)值。綜合前人研究經(jīng)驗[5]和特點，用“目標(biāo)重要性（TI）”來定義主要目標(biāo)評價指標(biāo)。其中，TI值與模塊中的關(guān)鍵目標(biāo)成正比關(guān)系，即TI值越大則表明模塊中擁有越多的關(guān)鍵目標(biāo)。

1.5 KEGG通路富集分析 使用在線分析工具DAVID[6]軟件針對上述26 個重要靶點進行KEGG通路注釋分析，設(shè)定閾值P＜0.05。再通過Omicshare云平臺系統(tǒng)對以上數(shù)據(jù)開展可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 活性組分的篩選 通過TCMSP、TCMID并結(jié)合文獻挖掘收集大黃蟄蟲丸中所含化學(xué)組分，以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為條件對化學(xué)組分進行篩選，確定大黃蟄蟲丸活性組分共226個，其中大黃19個、動物藥25個、桃仁26個、干漆0個、黃芩40個、白芍19個、苦杏仁19個、地黃5 個、甘草99 個，包含14 個共有化學(xué)組分。

2.2 核心靶點確定 將陽性藥預(yù)測靶點374 個（匹配度≥3）、DHZCP作用靶點282 個、CRC疾病相關(guān)靶點630 個取交集，獲得DHZCP治療CRC核心靶點34 個（見圖1）。這些靶點不僅與CRC疾病密切相關(guān)，同時是CRC常用化療藥物與DHZCP的共同作用靶點。

圖1 大黃蟄蟲丸、陽性藥與結(jié)直腸癌疾病相關(guān)基因交集靶點韋恩圖

2.3 關(guān)鍵藥效組分及主要靶點的網(wǎng)絡(luò)特性 借助系統(tǒng)NetworkAnalyzer插件進行計算網(wǎng)絡(luò)模型的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，通過網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的中心度值、網(wǎng)絡(luò)度及親中心度值可以獲得各節(jié)點的TI值。分析數(shù)據(jù)篩選出7 個T≥0.2 的關(guān)鍵藥效組分，依次為槲皮素、山奈酚、L-尿苷、白樺脂酸、漢黃芩素、異鼠李素、1-甲氧基菜豆素（見表1）。所篩選的關(guān)鍵組分不僅作用于更多的靶點，而且與眾多靶點之間的最短路徑的個數(shù)、接近程度均居于網(wǎng)絡(luò)前列。進一步篩選出包含NOS2、PPARG、PIK3CG、F2、GSK3B、CDK2、PGR、CHEK1 等在內(nèi)的出26 個主要靶點（見表2），其TI值均大于或等于0.11。

表1 7個關(guān)鍵藥效組分的網(wǎng)絡(luò)特性

表2 26個主要靶點的網(wǎng)絡(luò)特性

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析和關(guān)鍵靶點的篩選 把以上26 個重要靶點上傳至STRING平臺系統(tǒng)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。PPI網(wǎng)絡(luò)圖涵蓋節(jié)點數(shù)26 個和136 條互作邊，0.755 作為平均節(jié)點度值。將“節(jié)點-節(jié)點”依據(jù)綜合評分進行排序，排名靠前的分別為AKT1-NOS3，AKT1-GSK3B，CCNA2-CDK2，CASP3-MAPK14，NOS3-KDR，STAT1-MAPK14，AKT1-PIK3CG等。

圖2 大黃蟄蟲丸的26個共有靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.5 靶點生物功能及靶點-通路分析 將26 個重要靶點進行KEGG富集分析（P＜0.05），結(jié)果顯示涉及的相關(guān)信號通路共111 條。其中，共同靶點主要富集的關(guān)鍵通路為PI3K-Akt、TNF、VEGF、HIF-、FoxO、Apelin、MAPK信號通路等。

3 討 論

CRC常引起消化道出血、穿孔等并發(fā)癥，治療和預(yù)后效果不佳，復(fù)發(fā)和病死率較高。DHZCP出自《金匱要略》，是治療“五勞極虛[7]，贏瘦腹?jié)M，不能飲食”的著名方劑。臨床以DHZCP用于CRC術(shù)后輔助治療，具有較好的效果。

本研究通過篩選中藥方劑DHZCP的有效化學(xué)組分并對其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)進行分析，得到幾種重要組分。其槲皮素重要性排名最高（TI=0.44），研究顯示，槲皮素細(xì)胞增殖、促凋亡、抑制腫瘤血管生成和抗CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[8]。動物藥中重要性排名最高的組分為L-尿苷（TI=0.34），L-尿苷為RNA成分D-尿苷的對映異構(gòu)體，但缺乏抗CRC活性的相關(guān)報道。

KEGG通路富集分析：PI3K-Akt信號通路為DHZCP抗CRC通路中涉足基因數(shù)最多的信號通路，涵蓋GSK3B、MAPK1、PIK3CG、CDK2、KDR、AKT1、NOS3 共計7 個靶點。值得注意的是，參照STRING在線數(shù)據(jù)平臺分析結(jié)果，上述7 個靶點綜合評分均居于靶點互作網(wǎng)絡(luò)最前列，提示PI3KAkt信號通路可能為DHZCP發(fā)揮抗CRC作用的關(guān)鍵通路。DHZCP“單靶點”與“多靶點網(wǎng)絡(luò)”聯(lián)合的作用模式，或許為針對PI3K-Akt通路靶向藥物的研發(fā)提供思路。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，初步探索了經(jīng)典名方DHZCP治療CRC的作用機制。DHZCP通過多靶點、多途徑治療CRC，屬于系統(tǒng)性調(diào)控過程。至于DHZCP中化學(xué)成分與化學(xué)成分之間的相互作用、組分的含量以及藥物在體內(nèi)的代謝過程等對疾病的影響因素還需進一步探究。