APP、PIP在兒童支氣管哮喘中的作用

李 明 劉華清 畢雅茹

支氣管哮喘是常發(fā)生在兒童身上的慢性呼吸道系統(tǒng)疾病，并且隨著目前空氣不斷惡化，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[1]。由于支氣管哮喘發(fā)病原因復(fù)雜，影響因素較多，所以導(dǎo)致兒童支氣管哮喘的控制效果并不理想，治療效果反復(fù)，給患兒生活及學(xué)業(yè)帶來(lái)了諸多不便，嚴(yán)重影響了患兒家庭，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)了極大的負(fù)擔(dān)。哮喘臨床表現(xiàn)為氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和吸入性抗原引起的可變氣流阻塞[2]。目前認(rèn)為哮喘的發(fā)病機(jī)制與免疫、神經(jīng)、精神、內(nèi)分泌因素、遺傳學(xué)背景和神經(jīng)信號(hào)通路密切相關(guān)。在哮喘中，一些由組織細(xì)胞產(chǎn)生的特定蛋白質(zhì)可能被分泌到血液循環(huán)中。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)可能是一種有用的方法來(lái)檢測(cè)和定量這些血清蛋白，并確定他們是否在哮喘中有差異表達(dá)，并可能成為潛在的治療靶點(diǎn)[3]。

APP（淀粉樣前體蛋白）屬于I型跨膜糖蛋白，分子量在110～130 KD，分布于人體的心、腦、肺、腎等組織器官中；其構(gòu)成包含一個(gè)大型的N端膜外（氨基端）結(jié)構(gòu)域和較小的C 端胞尾區(qū)（胞內(nèi)羧基端）；APP蛋白從N端到C端共分成三個(gè)區(qū)域（E1、E2、E3），這三個(gè)區(qū)域都是高度保守的區(qū)域；其中，E1 和E2 兩個(gè)區(qū)域?yàn)榘饨Y(jié)構(gòu)部分，E3 區(qū)域?yàn)榘麅?nèi)結(jié)構(gòu)部分；APP經(jīng)β、γ分泌酶依次剪切后產(chǎn)生可溶性 APPβ（sAPPβ）和CTF99，以及導(dǎo)致阿爾茲海默癥發(fā)病主要原因的β淀粉樣肽（Aβ）[4]；APP的糖化可以影響其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)定位和成熟加工[5]。PIP（催乳素誘導(dǎo)蛋白）基因位于7 號(hào)染色體長(zhǎng)臂3 區(qū)4 帶（7q34），編碼含146 個(gè)氨基酸殘基組成的前體蛋白，成熟產(chǎn)物為17KD的單鏈糖蛋白。本文選擇APP、PIP兩個(gè)蛋白組學(xué)進(jìn)行分析，研究二者血清蛋白組學(xué)與兒童支氣管哮喘之間的關(guān)系，報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年10月-2022年10月本醫(yī)院東區(qū)兒科收治的40 例哮喘患兒作為觀察組。①納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡3～14 歲；確診依據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》（2016年版）；均未診斷為免疫性疾病、慢性和其他影響血清蛋白的疾??；入組前3 個(gè)月內(nèi)未服用相關(guān)益生菌制劑；且1 周內(nèi)均未接受過(guò)激素治療。②排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并過(guò)敏性鼻炎、急性呼吸道感染、肺部疾病、異物以及其他慢性疾病者；未參與其他的臨床研究。嚴(yán)格按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)納入患兒及其家屬進(jìn)行哮喘護(hù)理指導(dǎo)及健康培訓(xùn)，告知其相關(guān)注意事項(xiàng)及研究過(guò)程中可能存在的風(fēng)險(xiǎn)，簽署知情同意書(shū)；觀察組共納入40 例患者進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，其中男性20 例，女性20 例，年齡3～14 歲。對(duì)照組：選擇同期體檢正常的40 例兒童作為對(duì)照組，對(duì)兒童進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，其中男20 例，女20 例，年齡3～14 歲。兩組兒童在性別構(gòu)成、年齡分布等一般資料方面組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核同意，研究對(duì)象入選后由其家屬代替簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) ①標(biāo)本采集：患兒入院后第2 天上午，抽取靜脈血4 mL，置于室溫22 ℃～25 ℃黑暗1 h、上清液用移液管轉(zhuǎn)移至新管中，置于-80 ℃保存，采用ProteoExtract白蛋白/IgG去除試劑盒（Merck Co）提取血清樣本，各血清樣品總蛋白提取量均在400 μg以上，蛋白條帶清晰、完整、均勻。將蛋白溶液加入Bradford蛋白分析工作溶液。②指標(biāo)檢測(cè)：檢測(cè)總蛋白量后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和考馬斯藍(lán)染色評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量。使用iTRAQ技術(shù)標(biāo)記酶解后的肽段，蛋白定量后，將60 μg蛋白溶液置于離心管中，加入5 μL二硫蘇糖醇溶液，37 ℃靜置1 h，加入碘乙酰胺溶液20 μL，室溫避光1 h，離心，棄上清。用100 μL尿酸緩沖液（8 M尿素，100 mM Tris-HCl；pH值8.0）。用NH4HCO3（50 mM，100 μL）洗滌樣品三次，在超濾管中加入胰蛋白酶（蛋白與酶的比例為50：1）。樣品在37 ℃下酶解12～16 h。最后，用C18 標(biāo)記并脫鹽利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)關(guān)鍵蛋白葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）；顯微鏡直接計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞。

1.3 數(shù)據(jù)指標(biāo)收集 ①肺功能測(cè)量工具：德國(guó)耶格小兒肺功能儀。測(cè)量指標(biāo)：第一秒用力呼氣量（FEV1）、第一秒用力呼氣量/用力肺活量（FEV1/FVC）、用力呼氣中期流量（FEF）25%～75%、FEF 50%、FEF 75%；FEV1%是第一秒用力肺活量（FEV1）/用力肺活量（FEV）的比值。當(dāng)FEV1%＜70%時(shí)即為降低，70%-60%-40%分別為輕、中、重度降低。正常狀態(tài)，F(xiàn)EV1%大于80%，低于80%表明氣道阻塞性通氣障礙的存在，如哮喘。PEF是指測(cè)量用力肺活量時(shí)，呼氣流量最快時(shí)的瞬間流速，主要反映呼吸肌的力量及氣道是否被阻塞。MMEF%是用力呼氣曲線中間一半的平均用力呼氣流量的測(cè)量值與預(yù)測(cè)值之比，正常為＞70%，主要對(duì)反映小氣道病變，具有較高的準(zhǔn)確性及敏感性。測(cè)量頻次：每項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定3 次，計(jì)算平均值。注意事項(xiàng)：測(cè)量前詳細(xì)告知兒童及家長(zhǎng)相關(guān)注意事宜，測(cè)量前行容量校準(zhǔn)，4 歲以上1～3 L定量筒，3 歲以下為0.1 L定量筒。②嗜酸性粒細(xì)胞百分比：嗜酸性粒細(xì)胞百分比主要反映過(guò)敏性疾病中氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展和黏膜損傷修復(fù)等方面具有重要的臨床意義，其數(shù)值越高，提示氣道高反應(yīng)越明顯（正常值為0.4%～4%）。

1.4 APP、PIP相關(guān)蛋白表達(dá) 使用LC-MS/MS光譜系統(tǒng)鑒定了兩組之間的差異表達(dá)蛋白（DEPs）。標(biāo)記樣品在40 μL 0.1%甲酸水溶液中重新溶解后，采用LC -MS/MS進(jìn)行分析。流動(dòng)相為A相（2%乙腈/0.1%甲酸/98%水）和B相（80%乙腈/0.08%甲酸/20%水）。柱與95%液相A液相平衡。從B開(kāi)始的梯度調(diào)整如下：0～80 min，從0%線性增加到40%；80～80.1 min，增至95%；80.1～85 min，維持在95%；85～88 min，降至6%。分離樣品使用Q萃取HF-X質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行分析。使用Proteome Discover軟件，版本2.2.0.388，以FASTA格式搜索Uniport Human數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SigmaPlot軟件進(jìn)行雙尾Mann-Whitney檢驗(yàn)。分類變量（僅性別數(shù)據(jù)）比較采用Fisher精確檢驗(yàn)卡方檢驗(yàn)。計(jì)量資料使用（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蛋白質(zhì)折疊變化（FC）≥1.5，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FC＞1.5 表示蛋白上調(diào)，F(xiàn)C＜0.667 表示蛋白下調(diào)；FC在0.667～1.5 表明兩組之間的蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患兒肺功能指標(biāo)比較 觀察組患兒的FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%等肺功能指標(biāo)及含量均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組患兒肺功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

表1 兩組患兒肺功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

組別nFEV1(L)FEV1/FVCFEF 25%～75%FEF 75%FEF 50%對(duì)照組4090.43±6.3779.17±13.2574.53±13.2771.46±13.4273.64±13.46觀察組4086.15±5.2560.37±11.4652.57±14.3741.38±14.2517.32±10.37 t 3.3036.8357.1419.77512.09 P 0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 兩組患兒G-6-PD和嗜酸性粒細(xì)胞各組檢測(cè)結(jié)果比較 觀察組患兒G-6-PD均低于對(duì)照組，而嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。組別n 嗜酸性粒細(xì)胞(106/L) G-6-PD(u/g Hb)

表2 兩組患兒嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及G-6-PD數(shù)據(jù)比較

2.3 APP、PIP的相關(guān)性分析 APP、PIP的表達(dá)與觀察組患兒的FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%及G-6-PD呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與嗜酸性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，故二者在有或沒(méi)有哮喘的兒童血清中蛋白表達(dá)水平有顯著差異，見(jiàn)表3。

表3 APP、PIP的相關(guān)性分析

3 討 論

支氣管哮喘是由多種原因相互作用引起的慢性氣道炎癥。呼吸道慢性炎癥初始可引起呼吸道功能改變，由于炎性的慢性刺激可引起呼吸道結(jié)構(gòu)性改變?yōu)闅獾乐厮躘6]。哮喘的炎性涉及多種活化細(xì)胞，這些細(xì)胞釋放促炎癥細(xì)胞因子介質(zhì)升高，炎癥效應(yīng)引起不可逆的氣道結(jié)構(gòu)及功能上改變，其結(jié)構(gòu)性特征是氣道壁增厚、平滑肌細(xì)胞增生肥大等，引起氣道高反應(yīng)性及氣道阻塞，從而出現(xiàn)呼吸困難、喘息、胸悶等癥狀[7]。而新的哮喘管理范式，即通過(guò)使用“生物標(biāo)志物”對(duì)哮喘患者進(jìn)行分類，并開(kāi)出靶向治療處方，將取代“一刀切”的哮喘管理方法[8]。

在哮喘發(fā)病過(guò)程中，炎性細(xì)胞在氣道組織中的浸潤(rùn)、聚集、激活和釋放是其主要特征，在氣道重塑的過(guò)程中這些細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用[9]，在本研究中，觀察組患兒APP、PIP的表達(dá)與其FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%及G-6-PD呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與嗜酸性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。APP是一種廣泛表達(dá)的跨膜蛋白，在神經(jīng)元功能中起到不可或缺的作用，現(xiàn)已被證明可以促進(jìn)突觸形成、樹(shù)突狀發(fā)芽和神經(jīng)元遷移等作用，而在最新研究表明該蛋白參與了哮喘表達(dá)的上調(diào)，另外還通過(guò)了以下途徑：神經(jīng)元生長(zhǎng)、粘附、軸突生成、細(xì)胞遷移、蛋白運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、與細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合。有些研究還表明APP參與了腫瘤細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，如乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、肺癌等多種癌癥中具有顯著的功能[10]。APP通過(guò)β-分泌酶和γ-分泌酶參與的淀粉樣蛋白途徑水解后的主要產(chǎn)物，Aβ40 及Aβ42 是一種致病性淀粉樣蛋白，是阿爾茨海默病老年斑的主要成分[11]。致病性淀粉樣蛋白在腦組織中的沉積是導(dǎo)致阿爾茨海默病的病理基礎(chǔ)。PIP是一種小的分泌糖蛋白，為單條多肽鏈。在唾液腺、汗腺和淚腺等腺體中表達(dá)，存在于體液中。PIP在乳腺腫瘤患者的預(yù)后中具有重要價(jià)值，PIP高表達(dá)的乳腺腫瘤患者五年生存率及十年生存率更高。PIP在干眼病中表達(dá)過(guò)強(qiáng)，與干眼病的嚴(yán)重程度相關(guān)[12]。該蛋白亦具有免疫調(diào)節(jié)功能，并在細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)繼免疫中發(fā)揮重要作用，PIP與來(lái)自幾個(gè)屬的細(xì)菌結(jié)合，表明該蛋白可能也參與先天免疫和保護(hù)宿主免受微生物感染[13]，該蛋白也參與了哮喘表達(dá)的上調(diào)，對(duì)自然免疫細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用。PIP可以特異性降解纖維連接蛋白，幫助宿主抵抗感染，并在癌細(xì)胞的遷移、粘附和侵襲中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究顯示淀粉樣前體蛋白和泌乳素誘導(dǎo)蛋白在兒童哮喘中表達(dá)上調(diào)，與臨床相關(guān)指標(biāo)及參數(shù)密切相關(guān)，表明了APP、PIP與哮喘患兒的疾病特異性密切相關(guān)。這些研究結(jié)果均提示APP、PIP可能成為兒童哮喘潛在的檢測(cè)標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)，但需進(jìn)一步闡述APP、PIP在兒童哮喘產(chǎn)生發(fā)展的確切分子機(jī)制。