西藏凹乳芹多糖的分離純化、結構表征及抗氧化活性研究

趙澤素,南木加,劉雙平,毛健,4,5*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學), 江蘇 無錫,214122)3(西藏藏醫藥大學,基礎部,西藏 拉薩,850000)4(江南大學(紹興)產業技術研究院, 浙江 紹興,312000)5(國家黃酒工程技術研究中心,浙江 紹興,312000)

西藏凹乳芹(Vicatiathibeticade Boiss),為傘形科凹乳芹屬植物凹乳芹的根,在我國主要分布于西藏、四川、云南等地區[1],其在西藏、云南地區常被作為滋補菜肴食用,也是藏藥基礎五大根藥的重要組成[2]。據記載,西藏凹乳芹具有祛風除濕、散寒止痛的作用[3]。目前西藏凹乳芹中分離出多種生物活性成分,包括多糖、黃酮、香豆素、酚酸等[4]。目前對西藏凹乳芹的研究主要集中在藥理方面,對其化學成分和結構特征的報道較少。

多糖是一種天然的大分子碳水化合物,廣泛存在于動物、植物和細菌中[5]。多糖已被證明具有抗病毒、抗癌、抗氧化、降血糖、抗炎、免疫和調節腸道微生物活性的作用,由于其生物降解性、無毒性質、生物相容性和低加工成本等特點,被應用于許多領域[6]。西藏凹乳芹多糖(Vicatiathibeticade Boiss polysaccharide,VTP)是西藏凹乳芹的主要成分之一,因其具有抗疲勞[7]、抗氧化應激[8]、免疫調節[9]等作用成為研究熱點。多糖的提取是其開發或應用的最關鍵步驟,然而關于VTP提取和純化的進一步研究尚未見報道。

西藏凹乳芹資源豐富,是食品和醫藥行業應用的重要原料,目前主要被用于藏區人民食用和藏藥原料成分,且大部分只流通于西藏、云南等地區,還未覆蓋全國,對其的開發還處于基礎階段,未來具有廣闊的市場前景。因此本研究以拉薩市西藏凹乳芹為原料,通過對VTP的提取、分離純化、結構表征和體外抗氧化活性進行研究,旨在為充分利用西藏凹乳芹打下基礎,為VTP的進一步開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料:西藏凹乳芹,購于西藏昌都市藍寶石藥材有限公司拉薩分公司,經西藏藏醫藥大學南木加老師鑒定為西藏凹乳芹的根。

實驗試劑:木瓜蛋白酶、纖維素酶、苯酚、硫酸、無水乙醇、NaCl、NaOH,國藥集團化學有限公司;DEAE-cellulose 52、Sephadex G-100,北京索萊寶科技有限公司;系列葡聚糖標準品,美國聚合物標準品公司;單糖標準品,美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

R-1020旋轉蒸發器,杭州庚雨儀器有限公司;MAX-190型酶標儀,美國分子儀器公司;ME204號立式大容量多管離心機、Trace 1300 ISQ氣相色譜-質譜聯用儀、DIONEX ICS-5000+SP-5型高壓離子色譜系統,美國賽默飛世爾科技有限公司;Beta 1-8實驗室型凍干機,北京博勱行儀器有限公司;Waters 1525EF 型高效液相色譜儀,美國沃特世公司;NEXUS型傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)儀,美國尼高力儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 西藏凹乳芹粗多糖(VTP-0)提取工藝優化

1.3.1.1 單因素優化

西藏凹乳芹經50 ℃干燥后粉碎,過60目篩,備用。之后分別考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50, g∶mL)、復合酶(纖維素酶和木瓜蛋白酶,4∶6,質量比)添加量(0%、1%、2%、3%、4%,質量分數)、超聲溫度(35、45、55、65、75 ℃)、超聲時間(35、45、55、65、75 min)、超聲功率(250、300、350、400、450 W)對VTP-0得率的影響。在每個實驗中,在一定條件下,使用超聲輔助酶法提取5 g西藏凹乳芹粉,超聲結束后,95 ℃下水浴滅酶10 min,冷卻,4 500 r/min 離心15 min,得到VTP-0提取液,采用苯酚-硫酸法[10]測定VTP-0含量。

1.3.1.2 正交試驗優化VTP-0提取工藝

在單因素試驗基礎上,從5個單因素中選出4個比較重要的因素和因素的3個水平,以VTP-0得率為指標,采用L9(34)正交試驗設計,見表1,確定料液比(A)、超聲溫度(B)、超聲時間(C)、和超聲功率(D)的最佳組合,從而對VTP-0的提取條件進行優化。

表1 VTP-0提取的正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for VTP-0

1.3.2 VTP-0的分離純化

取上述VTP-0提取液上清液中加入無水乙醇至終體積分數為80%,4 ℃放置24 h后,4 500 r/min離心15 min,收集沉淀,冷凍干燥即得VTP-0。

取100 mg VTP-0溶于10 mL超純水,0.45 μm的水系濾膜過濾,用裝好的離子交換柱進行梯度洗脫,洗脫液為0、0.1、0.3、0.5 mol/L的NaCl溶液,洗脫速率為1 mL/min,洗脫時間為10 min/管。采用苯酚-硫酸法[10]測定每管洗脫液的總糖含量,根據洗脫管數和OD值繪制洗脫曲線。收集不同組分濃縮、透析、冷凍干燥。根據篩選結果使用超純水溶液進行SephadexG-100柱洗脫,流速為0.5 mL/min,收集單一組分,濃縮冷凍干燥得VTP-1。

1.3.3 VTP-1相對分子質量測定

參照DING等[11]的方法采用高效凝膠滲透色譜法測定。

1.3.4 VTP-1的單糖組成分析

參照GU等[12]的方法采用離子色譜法對VTP-1的單糖組成進行測定。

1.3.5 VTP-1紫外光譜和FT-IR分析

利用紫外分光光度計在200～400 nm掃描,掃描間距為1 nm,檢測在260、280 nm處是否含有核酸和蛋白質。

參照HE等[13]的方法,稱取VTP-1 5 mg置于FT-IR儀樣平臺上,固定樣品后,用FT-IR儀在4 000～500 cm-1掃描。

1.3.6 VTP-1的三螺旋結構分析

參照XU等[14]的方法,將100 μL VTP-1樣品(2 mg/mL)與100 μL剛果紅溶液(80 μmol/L)與系列濃度梯度的NaOH溶液(0～0.5 mol/L)混合均勻,室溫靜置5 min,使用酶標儀在200～700 nm測定其最大吸收波長的變化。

1.3.7 VTP-1的體外抗氧化活性測定

1.3.7.1 清除DPPH自由基能力測定

參考XIE等[15]的方法,并加以改動,將2 mL VTP-1溶液(1～10 mg/mL)與2 mL DPPH溶液,劇烈振搖混勻,在室溫下于黑暗處靜置30 min,測定混合物于517 nm處的吸光值,以無水乙醇作為空白對照。DPPH自由基清除能力計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A1,樣品溶液的吸光度;A2,無水乙醇代替DPPH-無水乙醇溶液的吸光度;A0,去離子水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.7.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考ZHAO等[16]的方法,將14 mmol/L ABTS溶液與4.9 mmol/L K2S2O8溶液1∶1(體積比)混合,于室溫下黑暗中放置16 h,用去離子水將混合液的734 nm處吸光度值調至0.700±0.020。取20 μL VTP-1溶液(1～10 mg/mL)和180 μL ABTS稀釋液,劇烈振搖混勻,靜置10 min后于734 nm處測定吸光值,以維生素C為陽性對照,去離子水為空白對照。ABTS陽離子自由基清除能力計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A1,樣品溶液的吸光度;A2,去離子水代替ABTS溶液的吸光度;A0,去離子水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.7.3 ·OH清除能力測定

參考CHEN等[17]的方法,在試管中依次加入VTP-1溶液(1～14 mg/mL)、9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸乙醇溶液、9 mmol/L H2O2溶液各1 mL混勻。將混合溶液于 37 ℃下溫育30 min,冷卻至室溫后測定510 nm處的吸光值,以維生素C為陽性對照,去離子水為空白對照,·OH清除能力計算如公式(3)所示:

(3)

式中:A1,樣品溶液的吸光度值;A2,去離子水替代H2O2溶液的吸光度值;A0,去離子水替代樣品的吸光度值。

1.4 數據分析

本研究各實驗設置3組平行,使用 Origin 2018進行統計分析,所有數據均表示為平均值±標準差。多重比較之間的差異采用單因素方差分析和 Fisher’s LSD 檢驗進行分析,P<0.05被認為是顯著的。

2 結果與分析

2.1 VTP-0提取工藝優化

2.1.1 VTP-0提取單因素優化結果

采用超聲輔助酶解法提取VTP-0,在控制其他條件不變的條件下,分別對料液比、酶添加量、超聲溫度、超聲時間、超聲功率進行了單因素試驗。結果表明(圖1),VTP-0在料液比為1∶30,酶添加量2%,超聲時間55 min,超聲功率300 W,超聲溫度65 ℃條件下得率最高,為(40.33±0.40)%。

a-料液比;b-酶添加量;c-超聲溫度;d-超聲時間;e-超聲功率圖1 VTP-0提取單因素實驗結果Fig.1 Single factor experiment results of VTP-0 extraction

2.1.2 正交試驗優化VTP-0的提取工藝

正交試驗優化VTP-0的提取工藝如表2所示,提取工藝優化過程中,以L9(34)正交試驗設計,并對結果進行直觀分析。R值與該因素對提取率影響呈正相關。提取率受各因素的影響程度由大到小依次為:A>D>C>B。最佳工藝組合為A2B1C2D3,即料液比1∶30(g∶mL),提取溫度55 ℃,提取時間55 min,超聲功率350 W,在該提取條件下VTP-0得率為(41.37±1.40)%,相對標準偏差為3.38%,表明精密度良好。對正交試驗結果進行方差分析,結果如表3所示,其中料液比對VTP-0得率的影響極顯著,其余3個因素均對VTP-0得率影響不顯著。

2.2 VTP-0分離純化

經提取、醇沉、冷凍干燥后得到的VTP-0,提取得率為(28.51±0.94)%。VTP-0經DEAE-cellulose 52離子交換柱分離,分別在水洗脫和梯度鹽洗脫部分得到4個峰,如圖2所示,命名為VTP-1、VTP-2、VTP-3、VTP-4。各組分所得多糖比率分別為(79.80±1.68)%、(10.82±0.53)%、(5.85±0.66)%、(3.53±0.26)%。考慮到收集時間與脫鹽成本,本實驗選擇VTP-1進行后續分離純化。經SephadexG-100凝膠柱純化后,得到單一對稱的單峰組分,證明VTP-1為較均一多糖,收集組分液,透析、干燥,其含量為(86.91±1.83)%。

表2 正交試驗結果及直觀分析Table 2 Orthogonal experiment results and range analysis of extraction of total flavonoids

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.3 VTP-1相對分子質量測定及單糖組成

重均分子質量(weight-average molecular weight,Mw)和數均分子質量(number-average molecular weight,Mn)是用于評價多糖理化性質的關鍵參數[18]。因此,使用高效凝膠滲透色譜測定VTP-1的分子質量,結果如表4所示。

a-DEAE-52洗脫曲線;b-SephadexG-100洗脫曲線圖2 DEAE-52纖維素柱色譜法洗脫曲線和 SephadexG-100洗脫曲線Fig.2 Elution curve of polysaccharides by DEAE-52 cellulose column chromatography elution curve and Sephadex G-100

VTP-1的Mw和Mn分別為96.81 kDa和56.28 kDa。多分散系數(Mw/Mn)為1.72,表明VTP-1是一種相對均質的多糖。

本研究采用高效液相色譜法分析VTP-1的單糖組成。如表4所示,VTP-1由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖等組成,摩爾比為5.63∶2.79∶86.36∶3.02∶1.59。由于VTP-1未有報道,與西藏凹乳芹同屬的傘形科當歸的研究表明[19],當歸多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖組成,摩爾比為8.4∶2.7∶1.8∶1.0,與本文分離純化得到的單糖種類及占比類似,葡萄糖占比最高。

表4 VTP-1的分子質量及單糖組成Table 4 Molecular weight and monosaccharide composition of VTP-1

2.4 紫外光譜和FT-IR分析

紫外可見光譜結果如圖3-a所示,VTP-1在紫外掃描范圍內均無吸收峰,表明VTP-1中不含有蛋白質和核酸。

a-紫外光譜;b-FT-IR圖3 VTP-1的紫外-可見光光譜和FT-IR分析Fig.3 Ultraviolet and visible spectra and FT-IR of VTP-1

2.5 VTP-1三維螺旋結構分析

具有三螺旋結構的多糖與剛果紅溶液結合時,會導致多糖與剛果紅復合物的最大吸收波長發生紅移[23]。因此,采用剛果紅測定法測定VTP-1的三螺旋結構。如圖4所示,VTP-1的最大吸收波長隨NaOH濃度的增加而減小,表明VTP-1不具備三螺旋結構。

圖4 VTP-1剛果紅實驗結果Fig.4 Results of Congo red with VTP-1

2.6 VTP-1的體外抗氧化活性

如圖5所示,VTP-1的抗氧化能力對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH的清除能力呈劑量依賴性,但仍不及陽性對照(維生素C)的抗氧化能力。在10 mg/mL時,VTP-1對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率分別可達到(92.45±0.62)%、(84.87±0.59)%;在14 mg/mL時,VTP-1對·OH清除率達到(93.82±2.34)%。VTP-1對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH清除率的IC50值分別為1.808、1.845、4.634 mg/mL。綜上所述,VTP-1的抗氧化活性按DPPH自由基>ABTS陽離子自由基>·OH的順序排列。

研究表明,多糖的抗氧化活性與其結構特性(分子質量、單糖組成、糖苷鍵類型和鏈構象等)有很大關系[24]。VTP-1的抗氧化活性受多種因素影響,而非單一因素的影響。本文提取得到的VTP-1分子質量較高(Mw=96.81 kDa),表現出了較強的抗氧化性。研究表明,低分子質量的灰喇叭菌酸性多糖具有較低的抗氧化性[25],而分子質量較高的羅漢果多糖不具有更強的抗氧化性[26]。因此,基于上述研究之間發現的不一致,表明多糖分子質量不是影響其抗氧化活性的主要因素。單糖中的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等的存在可能與抗氧化活性有關[27-28]。因此,VTP-1其單糖組成種類豐富可能是決定其有良好抗氧化性的原因。此外,多糖中的α-和β-型糖苷鍵也會影響多糖的抗氧化活性[29-30]。VTP-1同時含有α-和β-型糖苷鍵,這可能也是其抗氧化性良好的原因。總之,由于多糖的抗氧化機制復雜,因此多糖的抗氧化能力與結構特征之間的特異性相關性有待進一步研究。

a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽離子自由基清除率;c-·OH清除率圖5 VTP-1的體外抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activities of VTP-1 in vitro

3 結論

采用超聲輔助酶法提取得到VTP-0,最佳提取工藝為料液比1∶30(g∶mL),提取溫度55 ℃,提取時間55 min,超聲功率 350 W,VTP-0得率為(41.37±1.40)%。后續經DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱分離純化得到VTP-1。 結果表明,VTP-1的分子質量為96.81 kDa。VTP-1是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖組成,摩爾比為5.63∶2.79∶86.36∶3.02∶1.59;VTP-1為單一多糖,不含核酸和蛋白質。VTP-1具有多糖的特征吸收基團,同時含有α-和β-型糖苷鍵,且無三螺旋結構。VTP-1對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH清除率的IC50值分別為1.808、1.845、4.634 mg/mL,具有良好的體外抗氧化活性,證明了VTP的潛在藥用價值。本文對VTP的組分進行了初步研究,為進一步探討VTP抗氧化活性與結構的關系提供了一定的數據支持,但后續還需進一步探究VTP-1的結構與體內功能活性的關系。