羅望子多糖對冰重結晶、生長習性和量熱行為的影響

孫先保,宋紅,王江梅,吳艷,周煒

1(揚州市揚大康源乳業有限公司,江蘇 揚州,225004)2(上海交通大學 農業與生物學院,上海,200240) 3(山東省濰坊生態環境監測中心,山東 濰坊,261041)

控制冰晶尺寸對冷凍食品品質至關重要。添加抗凍劑是有效控制冰晶形成、生長和重結晶的重要方法,如滲透型小分子(二甲基亞砜、甲醇、甘油等)、非滲透型小分子(單、雙糖)、非滲透型聚合物、合成聚合物、納米材料和水凝膠等作為抑冰劑已經得到了廣泛研究和應用[1]。然而,這些抗凍劑潛在的安全風險及可能引入的感官變化往往不適合食品添加和應用。近年來,天然來源的大分子抗凍劑提供了活性可調、生物相容的選擇。如生物來源的抗凍(糖)蛋白可以通過“吸附抑制”機制產生熱滯效應、抑制冰重結晶和修飾冰晶形態[2],已被證實對冷凍食品具有優良的保護能力[3-5]。然而,天然抗凍(糖)蛋白來源少、不利于規模化生產以及潛在的健康隱患使其食品工業化應用面臨挑戰。除此之外,持續研究發現一些天然多糖,如卡拉膠[6-7]、納米纖維素[8-9]以及冷適應性生物來源的多糖[10-11]具有抗凍活性,其中一些作為穩定劑已在冷凍食品中得到了廣泛應用。天然多糖具有廣泛的可及性、再生性、無毒性和健康益處[12],是開發理想食品冷凍保護劑的潛在候選者。

目前,天然多糖抑制冰晶生長的確切機制尚未明晰,只有少數多糖具有可觀的冰重結晶抑制活性,其活性差異取決于多糖的結構類型[6]。近期針對卡拉膠、納米纖維素、瓜爾豆膠等多糖穩定劑的研究表明,多糖溶液的黏度或凝膠化并不能解釋其冰晶生長抑制活性,而是可能與抗凍蛋白冰結合作用類似的機制發揮作用[6-8]。CARILLO等[10]通過分子模擬技術發現一種從嗜冷海洋細菌Colwelliapsychrerythraea34H中提取的多糖可以形成特殊的“膠囊”結構,與冰晶表面通過特定的氫鍵作用結合而抑制冰晶生長;而GUERREIRO等[11]發現胞外多糖FucoPol表現出非依數性、濃度依賴性的冰點增加效應,認為多糖鏈水合參與界面冰-水相互作用可能解釋其冷凍保護作用。

羅望子多糖(tamarind seed polysaccharide,TSP)是從羅望子(TamarindusindicaL.)種仁中提取純化的一種半乳糖木葡聚糖,由β-D-(1→4)-葡聚糖的纖維素骨架以及半乳糖和木糖的分支組成的九糖重復單元[13]。木葡聚糖的特殊結構賦予TSP良好的水合性和熱震穩定性,可以改善冷凍面團[14]、肉[15]等制品的凍融和貯藏穩定性。據日本Dsp Gokyo公司2014年的技術通報(https://www.fc.sumitomo-pharma.co.jp/en/)顯示,TSP可以穩定冰淇淋中的冰晶尺寸,推薦其用于冷凍甜品冰晶穩定劑。作為一種極具開發潛力的天然大分子冷凍保護劑,尚缺乏系統的研究來理解TSP對冰晶生長的抑制效應。為此,本文通過研究TSP的冰重結晶抑制活性、重結晶動力學、冰晶生長習性以及對水溶液相變的熱力學影響,系統理解該多糖對冰晶生長的抑制效應,為其食品應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羅望子多糖(TSP,純度90.1%;蛋白含量1.1%,水分8.8%,灰分0.3%,均為質量分數),云南貓哆哩集團食品有限公司,進一步純化(80 ℃加熱溶解、離心、4倍體積95%乙醇沉淀、凍干),達到98.95%純度;聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG,黏均分子質量Mv約為100 000 g/mol)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA,純度95%,重均分子質量Mw為89 000～98 000 g/mol),上海麥克林生化有限公司;其他化學品均為分析級。

1.2 儀器與設備

多角度激光散射凝膠色譜系統,美國Wyatt技術公司;Olympus BX51顯微鏡配置Canon EOS 500D SLR相機,日本Olympus公司;BCS196生物低溫控制臺,英國Linkam科學儀器公司;差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)儀2500,美國TA儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 尺寸排阻色譜和多角度激光散射(size exclusion chromatography-multi-angle laser light scattering,SEC-MALLS)分析

采用高效尺寸排阻色譜初步分析TSP的溶液分子特征。配制不同質量濃度(1、2、5 mg/mL)的多糖溶液,80 ℃下持續攪拌至完全溶解,4 ℃下過夜,離心(10 000×g,10 min)去除不溶物后上樣分析。該色譜系統包括多角度激光散射(multi-angle laser light scattering,MALLS)檢測器、示差折光檢測器和紫外檢測器,采用SB-G 6B保護柱串聯SB-805 HQ和SB-803 HQ分析柱,流動相為0.1 mol/L NaNO3,流速0.5 mL/min,柱溫35 ℃,上樣量100 μL。其中,TSP水溶液(25 ℃)的示差折光指數增量(dn/dc)為0.145 mg/mL。采用ASTRA 7.1.3軟件分析樣品的重均分子質量(Mw)、數均分子質量(Mn)、多分散指數(PDI=Mw/Mn)和z-均回轉半徑(rz)等分子特征參數。

1.3.2 “蔗糖三明治”冰重結晶試驗

以49%(質量分數,下同)的蔗糖溶液為空白體系,研究添加TSP對冰重結晶過程的影響。通過不同蔗糖、純水、TSP質量比配制含0.01%～0.5%(質量分數,下同)多糖的樣品溶液,含1%(質量分數,下同)PEG和1%(質量分數,下同)PVA分別作為陰性對照和陽性對照[16]。吸取約1.5 μL樣品溶液滴加于2塊玻片(直徑12 mm)間,浸油密封,置于冷臺。將樣品以30 ℃/min迅速降溫至-40 ℃誘導形成多冰晶,保持2 min,以10 ℃/min升溫至-8 ℃,維持30 min。等溫(-8 ℃)退火期間,觀察并記錄冰晶的生長過程,樣品臺內外均緩慢流通N2防止環境水凝結霧化影響觀察視野。獨立重復3次試驗,采用ImageJ軟件測量每張圖片中至少50個冰晶的尺寸,取3次測量的平均值。

1.3.3 冰重結晶動力學

基于Lifshitz-Slyozov-Wagner(LSW)理論描述的Ostwald熟化過程[17],研究冰重結晶過程中的生長動力學。如果冰重結晶過程是由水分子通過中間液相從小冰晶向大冰晶的擴散主導,那么LSW理論認為晶體的平均半徑r隨時間演變應遵循公式(1):

(1)

其中,r0,重結晶t=0 min時的初始平均半徑;kd,重結晶的速率常數。試驗采用49%蔗糖溶液體系可以確保Ostwald熟化(或遷移重結晶)占主導地位的較大的非凍結液相比例。因此,在半徑r隨時間t的演變過程中,重結晶的速率常數kd可以通過公式(1)線性回歸之間的斜率確定。

1.3.4 動態冰晶修飾試驗

在含0.25%(質量分數)TSP的蔗糖模型溶液(含質量分數49%的蔗糖水溶液)中觀察單冰晶生長的動態變化,含0.25%(質量分數)的PEG和0.25%(質量分數)PVA分別作為陰性和陽性對照,研究樣品添加對冰晶生長形貌的影響。如1.3.2節所述,將樣品溶液降低至-40 ℃后升溫至-8 ℃,等溫退火30 min,隨后以0.5 ℃/min升溫直到視野中的冰晶僅剩無幾,再以0.1 ℃/min緩慢冷卻,期間觀察單冰晶生長的形貌變化。

1.3.5 差示掃描量熱法分析

采用差示掃描量熱法研究樣品溶液的量熱行為,數據采集從25 ℃開始(平衡1 min),以3 ℃/min降溫至-70 ℃(等溫1 min),再以相同速率升溫至25 ℃(等溫1 min)。測試樣品為0.01%～1.5% TSP、1%PEG和1%PVA的水溶液,空密封鋁皿作為參照,至少進行3次獨立的DSC測試。使用儀器配置的TRIOS軟件進行數據分析,確定溶液平均凍結/非均相成核溫度(Tf)、平均融化溫度(Tm)以及相應的平均焓值(結晶焓ΔHc,融化焓ΔHm)。

2 結果與分析

2.1 羅望子多糖分子特征的初步分析

采用SEC-MALLS初步研究TSP在不同濃度下的分子特征。基于色譜峰(圖1)計算的相關分子特征參數結果如表1所示,TSP的Mw和Mn濃度依賴性降低,1、2和5 mg/mL質量濃度下檢測的Mw分別為1.97×106、1.18×106和0.98×106Da,而rz分別為67.9、58.7和55.5 nm。此外,通過主要分子質量分布區間和rz的函數關系可以研究TSP溶液中主要的分子構象差異(圖1-b～圖1-d)。理想情況下,斜率為0.33代表球形構象,斜率為0.5～0.6代表隨機線圈,而斜率1代表剛性棒狀構象[18]。因此,TSP在質量濃度為2 mg/mL時斜率為0.565,表明該濃度下TSP呈柔性線圈構象;TSP在質量濃度5 mg/mL時斜率為0.477,說明構象趨于緊湊,介于球形和柔性隨機線圈結構之間;而低質量濃度(1 mg/mL)TSP顯示獨特的U-型分布,這是高支化聚合物的典型特征。這種現象可以用伴隨發生的相反分離機制來解釋,即在小的洗脫體積下,正常的尺寸排阻分離機制占優勢,此時小的洗脫片段的多分散性可以忽略;而在較大的洗脫體積下,洗脫的小分子質量多糖與延遲的高分子質量聚合物共流出,增加了洗脫“片段”的多分散性。因為均方根半徑隨多分散性的增加比Mw更加顯著,所以曲線隨著多分散系數的增加而向上位移,形成獨特的U型曲線[19]。上述結果表明,TSP的溶液分子構象具有復雜的濃度依賴性。

a-不同濃度TSP的HPSEC-MALLS色譜圖;b-1 mg/mL TSP的均方回轉半徑分布圖;c-2 mg/mL TSP的均方回轉半徑分布圖; d-5 mg/mL TSP的均方回轉半徑分布圖圖1 不同濃度TSP的HPSEC-MALLS色譜圖和均方回轉半徑分布圖Fig.1 HPSEC-MALLS-RI chromatograms and distribution of z-average radius of gyration (rz) for TSP at different concentrations

表1 SEC-MALLS分析的TSP分子特征Table 1 Molecular characteristic of TSP from SEC-MALLS analysis

2.2 羅望子多糖的冰重結晶抑制活性

如圖2所示,“蔗糖三明治”冰重結晶試驗退火過程(Ostwald熟化)中,冰晶尺寸逐漸增大,而總冰晶數量減少。空白對照(質量分數49%蔗糖溶液)和陰性對照(空白對照49%蔗糖溶液中含1%PEG)退火30 min后的冰晶尺寸比含TSP溶液中的冰晶更大(圖3),而含PVA溶液中的冰晶最小,表明TSP具有顯著的冰重結晶抑制活性,但活性遠低于PVA。不同質量分數(0.01%～0.5%)TSP溶液中冰晶在退火30 min后的尺寸分布如圖4-a所示,與未添加TSP的溶液相比,添加TSP后形成的冰晶尺寸分布更窄,當TSP質量分數從0.01%增加到0.25%時,冰晶分布趨向更小的尺寸。然而,當質量分數增大到0.5%時,尺寸分布反而變寬,粒徑變大。尺寸分布的統計結果如表2所示,空白組和陰性對照形成的冰晶平均半徑分別為6.08和5.46 μm,添加0.25%TSP形成的冰晶半徑為3.05 μm,而添加0.5%TSP的冰晶半徑為3.71 μm,這與肉眼觀察到的結果一致。值得注意的是,這里沒有顯示PVA溶液的冰晶尺寸分布,因為1%(質量分數)PVA在30 min內幾乎完全抑制冰重結晶,冰晶尺寸幾乎沒有變化,因此很難進行單獨測量。總的來說,TSP從0.01%到0.25%范圍內顯示劑量依賴性活性增加,而當質量分數增加到0.5%時活性略有降低。

圖2 等溫退火過程中的冰晶生長過程(Ostwald熟化)Fig.2 Growth process of ice grains during annealing (Ostwald ripening)

a-49%蔗糖;b-49%蔗糖+1%PEG;c-49%蔗糖+1%PVA; d-49%蔗糖+0.1%TSP;e-49%蔗糖+0.25%TSP; f-49%蔗糖+0.5%TSP圖3 冰重結晶過程中等溫(-8 ℃)退火30 min后的 冰晶顯微圖片Fig.3 Micrographs of ice crystals grown after annealing 30 min at -8 ℃

如圖4-b所示,重結晶過程中冰晶平均半徑的三次方隨時間的變化可以采用線性生長函數擬合(R2>0.9),表明測試溶液中的冰重結晶動力學由LSW理論提出的水分子擴散主導[17]。如表2所示,與空白蔗糖溶液的冰重結晶速率相比(kd=9.93 μm3/min),含TSP溶液的冰重結晶速率常數顯著降低,其中0.25%(質量分數)TSP溶液中的冰晶生長速率最慢,kd為0.98 μm3/min,而0.5%(質量分數)TSP中冰晶的生長速率略有增加,kd為2.20 μm3/min。

a-冰晶尺寸分布;b-冰晶生長動力學(t=2～30 min)圖4 冰晶尺寸分布和重結晶動力學Fig.4 Ice size distribution and recrystallization kinetics

表2 冰晶的尺寸分布統計和生長速率常數Table 2 Ice crystals size distribution and growth rate constants (kd)

2.3 冰晶生長習性

動態冰晶修飾試驗中不同溶液中的冰晶生長形貌如圖5所示,空白溶液(49%蔗糖)中的冰晶呈圓形,少數呈拉長狀。添加PEG對冰晶的生長形貌沒有顯著影響,表明其與冰晶界面沒有明顯的相互作用,而PVA可以與特定冰晶表面結合[20],因此顯示較強的冰晶形貌修飾能力,含PVA的蔗糖溶液中冰晶均呈針狀和拉長狀。與上述對照組相比,TSP溶液中形成少量的針狀和不規則冰晶,暗示TSP與冰晶表面可能存在弱的相互作用。

a-49%蔗糖;b-49%蔗糖+PEG;c-49%蔗糖+TSP; d-49%蔗糖+PVA圖5 不同溶液中的冰晶生長形貌Fig.5 Growth morphology of ice crystals of different solutions

2.4 量熱行為分析

采用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)研究TSP對溶液相變的熱力學影響。如圖6所示(數據統計結果見表3),純水在-15.18 ℃附近的過冷溫度范圍凍結,隨后的升溫過程中凍結相在-0.81 ℃附近融化。TSP溶液的凍結溫度(Tf)降低,表明在溶液緩慢冷卻過程中TSP抑制了(非均相)成核,其中0.01%、0.1%、0.25%和0.5%TSP的冰點抑制溫度(ΔTf,TSP溶液初始凍結溫度與空白對照初始凍結溫度的差值)分別為-1.74、-4.36、-6.43、-6.15 ℃。而當TSP質量分數增加到1.5%時,ΔTf為-2.96 ℃。在當前測試條件和濃度范圍內,TSP溶液沒有表現出玻璃化轉變和冷結晶事件。在隨后的加熱過程中,TSP溶液的融點溫度沒有顯著變化。作為對照,1%PEG和1%PVA的ΔTf分別為-2.78和-8.52 ℃,而Tm比空白組略低。

a-凍結行為;b-融化行為圖6 TSP水溶液的DSC分析Fig.6 DSC analysis of TSP aqueous samples

表3 樣品溶液的熱力學數據統計Table 3 Summary of thermodynamic data of samples

3 討論

為發展高品質冷凍食品,長期以來,科學界一直關注于合成的小分子抗凍劑,但天然來源的多糖大分子提供了生物相容的替代性選擇。利用天然多糖抑制冰晶生長(重結晶)的研究一直在持續,但很少具有可觀的抗凍活性[12],仍需持續發掘自然界中具有顯著抗凍能力的食品多糖資源,并進一步理解其發揮抗凍活性的潛在機理。

在本研究中,SEC-MALLS結果初步顯示TSP在溶液中具有濃度依賴性構象變化,可能是因為分子自聚集行為所致[21],這種復雜的溶液行為可能會影響其冷凍保護活性。冰重結晶抑制試驗采用高質量分數(49%)蔗糖體系可以避免假陽性[16],其產生低冰相分離的冰晶可以進一步定量冰晶生長的動力學數據,為TSP應用于冷凍甜品提供了更為精確的研究模型。結果顯示,TSP具有優良的冰晶生長抑制能力,且活性受濃度變化影響。值得注意的是,TSP和合成聚合物PVA相比,活性較低,但和其他已報道的具有抗凍活性的天然多糖如卡拉膠[6]、瓜爾膠和納米纖維素[8]等相比,TSP表現出較高的競爭潛力。和生物低溫保存不同,一些食品應用如冰淇淋等需要小冰晶賦予產品理想的口感,因此可以認為TSP用于冰淇淋等冷凍甜品的新型抑冰劑具有較大潛力。

冰重結晶動力學數據顯示在實際應用中多糖濃度篩選的重要性,如在當前條件下,0.25%TSP(而非0.5%)顯示最高的冰重結晶抑制活性。這種濃度依賴性但非持續性增加的活性變化也提示我們進一步探索TSP抑制冰晶生長的潛在作用機制。LI等[8, 22]研究發現,多糖類穩定劑的冰重結晶抑制活性與未凍結相中穩定劑濃度和冰晶總表面積的比值相關,且顯示時間依賴性冰晶表面覆蓋,為多糖類大分子的冰結合機制提供了有力證據。顯然,當前研究結果也表明TSP的溶液黏度與冰重結晶抑制活性并不相關,且TSP顯示一定(較弱)的冰晶形貌修飾活性,這些結果支持了多糖與冰晶相互作用的推測。因此,當多糖質量分數增加到0.5%時,TSP進入不同的鏈糾纏狀態或自聚集趨于更加緊密的結構,可能改變了與冰晶表面的結合行為(相互作用可及性降低),導致活性略有降低。然而,當前結果并未排除由于未凍結相冷凍濃縮而凝膠化的影響。

此外,重結晶過程中的冰晶大小也受到初始成核行為的影響。盡管采用DSC測定溶液凍結溫度存在一些預期的隨機變化,但總體趨勢非常明顯。TSP對非均相成核溫度具有一定的抑制效應,但不呈線性濃度依賴性增大。基于Gibbs-Thomson效應,凍結溫度降低可以解釋為聚合物與冰晶相互作用誘導形成曲率的結果[23]。PVA可以與冰晶表面特定的氫鍵結合,具有較強的凍結溫度抑制能力,但TSP與冰晶表面的弱相互作用似乎不足以解釋其有效的凍結溫度抑制能力。因此,TSP抑制冰晶生長(重結晶)可能存在更加復雜的作用機制。此外,TSP在測試濃度范圍內未顯示任何玻璃化轉變或冷結晶事件,表明在當前測試質量分數<1.5%時不會通過玻璃化食品系統發揮冷凍保護作用。

水化動力學對碳水化合物基抗凍劑具有非常重要的意義[24],大多數親水性多糖與水分子的相互作用會擾動水的氫鍵網絡,從而影響水的熱力學和動力學性質。CHEN等[25]通過分子動力學模擬研究表明,吸附在TSP周圍的水分子擴散系數遠小于體相水(僅相當于體相水的15%)。因此,不難推測TSP水合會影響體相水分子到冰/水界面(準液層)擴散的熱力學和動力學性質[24-25],從而影響冰的生長和重結晶。從這點來說,濃度增大導致活性降低可能與分子聚集增加了局部的脫水合作用有關。然而,目前尚缺乏多糖類大分子與冰晶表面相互作用以及通過水氫鍵網絡擾動抑制冰晶生長的直接證據,需要進一步的工作來確證并闡明其分子和原子細節。

4 結論

本研究系統評估了TSP的冰晶生長抑制效率。 結果表明,TSP具有優良的冰重結晶抑制活性,其中0.25%TSP對冰重結晶的抑制效果最好。單冰晶形貌變化暗示TSP與冰晶表面可能存在較弱的相互作用,量熱分析顯示TSP具有一定的冰點抑制效應而對融點沒有顯著影響。推測TSP的抑冰機理可能和其與冰晶表面的弱相互作用和水化動力學有關,但仍需進一步證據確證并闡明其作用的分子和原子細節。總的來說,利用天然TSP作為新型食品抑冰劑具有巨大潛力,但目前針對大分子抗凍劑的活性和實際應用效果的聯系仍未得到充分理解,需在實際食品體系中進一步研究。