不同多糖對(duì)雞肝酶解液美拉德反應(yīng)的影響及其產(chǎn)物應(yīng)用

王晴,蔡皓雯,陸信曜,諸葛斌,宗紅

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,工業(yè)微生物研究中心,江蘇 無(wú)錫,214122)

雞肝含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),包括多種人體必須氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等。但是,由于雞肝口感較差,具有苦澀味和令人不愉快的肉腥味,通常情況下會(huì)被作為食品垃圾丟棄[1]或者被用在動(dòng)物飼料或?qū)櫸镎T食劑中[2-3],這造成了高質(zhì)蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)。

為提高雞肝蛋白質(zhì)的利用價(jià)值,大多使用蛋白酶在安全、高效、溫和的條件下將其分解為生物活性肽和游離氨基酸,再通過(guò)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生如醛、酮、呋喃、噻吩、吡嗪、吡咯等多種化合物,這些物質(zhì)可以賦予食品令人愉快的花香、堅(jiān)果味、焦糖味以及誘人的肉香味[4],還可以大幅度提高雞肝的抗氧化和抑菌等生物活性。陳曉[5]將雞肝酶解物與木糖進(jìn)行美拉德反應(yīng),發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物對(duì)·OH、DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力顯著提高,而且有明顯的抑制大腸桿菌和金黃色葡糖球菌生長(zhǎng)的效果。李佳怡等[6]以雞肉、雞心、雞肝(質(zhì)量比為1∶2∶1)為主要原料,對(duì)美拉德反應(yīng)配料和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,美拉德反應(yīng)可以改善食品色澤,增加食品的肉香味和烘烤香。符笳茵等[7]利用雞胸肉酶解液和木糖進(jìn)行美拉德反應(yīng),發(fā)現(xiàn)酶解程度越大,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products,MRPs)對(duì)Fe3+還原能力與DPPH自由基清除能力越強(qiáng)。

目前關(guān)于糖類參與肉類蛋白水解物美拉德反應(yīng)的研究多集中在單糖上,湯龍等[8]將大豆蛋白和雞肉分別酶解,在得到的肽段和氨基酸中添加一定量木糖進(jìn)而構(gòu)建美拉德反應(yīng)模型,XIONG等[9]利用響應(yīng)面法獲得了木糖與雞肝水解液美拉德反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件,并增強(qiáng)了產(chǎn)物的抗氧化活性,提高了雞肝的附加值。很少有關(guān)于多糖在美拉德反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生作用的研究報(bào)道。多糖參與美拉德反應(yīng)可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和生物活性[10]。本研究以雞肝蛋白酶解液為原料,研究不同多糖對(duì)其美拉德反應(yīng)的影響,從風(fēng)味和抗氧化性能的角度考察產(chǎn)物特性并進(jìn)行應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

主要材料:雞肝,蘇州集合維康生物科技有限公司;胰蛋白酶(4 000 U/g),河南華美萬(wàn)邦化工科技有限公司;動(dòng)物蛋白酶(100 000 U/g),圣鑫生物科技有限公司;半胱氨酸、維生素B1(食品級(jí)),河南萬(wàn)邦化工科技有限公司;菊粉多糖,山東齊魯生物科技樣品店;平菇多糖,漢中漢溯源生物科技有限公司;黃芪多糖,開(kāi)封寶來(lái)利來(lái)農(nóng)牧有限公司;黃豆,江蘇永輝超市有限公司;MgCl2,食品級(jí),連云港日豐鈣鎂公司。

主要儀器:HJ-4A四聯(lián)異步恒溫?cái)?shù)顯磁力攪拌器,鼎鑫宜實(shí)驗(yàn)設(shè)備;TU-1810紫外分光光度計(jì),北京普析通用公司;UltraScan PRO高精度分光測(cè)色儀,美國(guó)HunterLab公司;NEXUS傅里葉紅外光譜儀,美國(guó)尼高力儀器公司;TSQ 8000三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀,賽默飛世爾科技有限公司;synergy H4多功能酶標(biāo)儀biotek, 美國(guó)伯騰儀器有限公司;TA.XTPlus物性分析儀,英國(guó)SMS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞肝酶解液與多糖MRPs的制備

將雞肝絞碎成肉糜,加入兩倍體積水,100 ℃加熱 20 min使內(nèi)源性酶失活,用NaOH溶液(1 mol/L)調(diào)節(jié) pH值為6.5±0.2,加入混合酶(胰蛋白酶和動(dòng)物蛋白酶按照2∶1的酶活性比混合),置于45 ℃恒溫磁力攪拌器上酶解反應(yīng)3 h,反應(yīng)結(jié)束后于100 ℃加熱15 min使蛋白酶失活,冷卻后得到雞肝酶解液。

將雞肝酶解液、多糖、半胱氨酸、維生素B1按照100∶10∶2∶1的質(zhì)量比混合,調(diào)節(jié)pH值為8.0±0.2,在110 ℃條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng),60 min后立即冷卻,于10 000 r/min離心10 min,沉淀物凍干,上清液置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

MRPs分為4組:在美拉德反應(yīng)過(guò)程中不添加多糖得到的產(chǎn)物為(free polysaccharide, chicken liver protease hydrolysate Maillard reaction products,CLPHM-FP);分別添加菊粉多糖(inulin polysaccharides, IP)、平菇多糖(flat mushroom polysaccharides,FMP)和黃芪多糖(astragalus polysaccharides,AP),得到的對(duì)應(yīng)產(chǎn)物分別為CLPHM-IP、CLPHM-FMP和CLPHM-AP。

1.2.2 褐變強(qiáng)度和中間體測(cè)定

使用紫外分光光度計(jì),取MRPs的上清液分別用去離子水稀釋10倍和200倍,通過(guò)420 nm和294 nm處的吸光度值測(cè)量MRPs的褐變強(qiáng)度和中間產(chǎn)物的形成程度。

1.2.3 色度值測(cè)定

對(duì)MRPs的凍干沉淀物使用高精度測(cè)色儀,在反射模式下使用D 65/10光源和Hunter LAB刻度進(jìn)行測(cè)量。

1.2.4 傅里葉紅外光譜測(cè)量

使用Nexus型傅立葉變換紅外光譜儀對(duì)MRPs的凍干沉淀物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,掃描光譜的波數(shù)范圍為378～4 000 cm-1,波數(shù)精度為0.01 cm-1,分辨率為≤0.5 cm-1。

1.2.5 GC-MS分析

樣品處理:取4.0 g MRPs的凍干沉淀物溶于5 mL去離子水中,加入二氫獼猴桃內(nèi)酯作為內(nèi)標(biāo),于頂空進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

GC-MS檢測(cè)條件:使用TG-WAX(60 m×0.25 mm×0.32 μm)色譜柱;載氣He;進(jìn)樣口溫度270 ℃;升溫程序?yàn)?0 ℃保持1 min,以3 ℃/min 升溫至180 ℃,再以20 ℃/min 升溫至230 ℃,保持12 min。電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;離子源溫度300 ℃,離子掃描范圍20～400m/z;傳輸線溫度280 ℃;四級(jí)桿溫度150 ℃,通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索,確定各組分結(jié)構(gòu)。化合物相對(duì)含量計(jì)算,使用Xcalibur工作站利用面積歸一化法計(jì)算各組分峰面積百分比?；衔锒坑?jì)算如公式(1)所示,氣味活度值(odor activity value, OAV)計(jì)算如公式(2)所示:

(1)

式中:w待,待測(cè)揮發(fā)性組分質(zhì)量分?jǐn)?shù),μg/kg;A待,待測(cè)揮發(fā)性組分的峰面積;w,內(nèi)標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù),μg/kg;A內(nèi)標(biāo),內(nèi)標(biāo)組分在MS上的峰面積。

(2)

式中:OAVi為某揮發(fā)性物質(zhì)的氣味活度值;wi為某揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),μg/kg;OTi為某揮發(fā)性物質(zhì)的氣味閾值,mg/kg;10-3為單位換算系數(shù)。

1.2.6 抗氧化性分析

將MRPs的凍干沉淀物重新溶解在去離子水中,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液。

1.2.6.1 ·OH清除活性測(cè)定

根據(jù)XIONG等[9]方法并稍作修改,將樣液按照如下添加:0.05 mL FeSO4溶液(2 mol/L),0.05 mL H2O2溶液(6 mmol/L),Ai:0.05 mL水楊酸溶液(6 mol/L),0.05 mL樣品溶液,Aj:0.05 mL稀釋水,0.05 mL樣品溶液,A0:0.05 mL稀釋水,0.05 mL水楊酸溶液,反應(yīng)30 min后在510 nm處測(cè)量吸光度?！H清除率計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

1.2.6.2 DPPH自由基清除活性測(cè)定

根據(jù)李嬌等[11]方法并稍作修改,將樣液按照如下添加:Ai:0.1 mL DPPH溶液[0.04 mg/mL,75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液]和0.1 mL樣品溶液,Aj:0.1 mL無(wú)水乙醇和0.1 mL樣品溶液,A0:0.1 mL無(wú)水乙醇和0.1 mL DPPH溶液,避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)量吸光度,DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(4)所示:

(4)

1.2.6.3 還原能力測(cè)定

根據(jù)李嬌等[11]方法并稍作修改,向2 mL待測(cè)溶液中加入2 mL磷酸鹽緩沖液和2 mL鐵氰化鉀溶液(0.01 g/mL),在50 ℃的水浴中反應(yīng)20 min,加入2 mL三氯乙酸溶液(0.1 g/mL)終止反應(yīng)。10 000 r/min離心30 min,取2 mL上清液,加入2 mL蒸餾水和0.4 mL FeCl3溶液(0.001 g/mL)反應(yīng)10 min,在700 nm處測(cè)量吸光度Ai(用蒸餾水代替樣品作為空白Aj)。還原力的計(jì)算方法如公式(5)所示:

還原力=Ai-Aj

(5)

1.2.7 雞肝酶解液MRPs在素雞中的應(yīng)用

1.2.7.1 素雞制備

千張的制備:取黃豆并加5倍體積水,浸泡12 h后瀝干水分并添加3倍體積水,放入打漿機(jī)中破碎,將混合物放入濾布中,擠出豆?jié){,豆?jié){保持煮沸2 min,邊煮沸邊攪動(dòng),后關(guān)火靜置10 min,將MgCl2、MRPs的凍干沉淀物,按照50∶9∶3 000(g∶g∶mL)的比例添加到冷卻的豆?jié){中(多次緩慢加入),在方形模具中鋪好紗布,將豆花均勻鋪在紗布上,層層相加,在最上層重壓5 h,壓出水分,紗布和千張晾干后取下千張。

素雞的制備:將千張鋪展,加入5倍體積水沒(méi)過(guò)千張,再用紗布卷緊,用繩子緊緊纏繞紗布,加熱滅菌10 min后取出,待千張冷卻后取下繩子和紗布即為素雞。

制備的素雞分為3組:K為空白對(duì)照組,不加MRPs制備成的素雞;CLPHM-FP素雞和CLPHM-FMP素雞分別為在制備過(guò)程中添加了CLPHM-FP和CLPHM-FMP。

1.2.7.2 物性分析

將素雞切成厚度約為1.0 cm,直徑約1.0 cm 的圓柱體,使用物性分析儀在質(zhì)地剖面分析模式下測(cè)定,選用硬度、彈性、咀嚼性、凝聚性等為指標(biāo),通過(guò)軟件分析得出樣品的質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所做平行次數(shù)均為3次,取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),Origin 2023繪圖,采用 IBM SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同多糖對(duì)美拉德反應(yīng)程度的影響

420 nm處的褐變強(qiáng)度和294 nm處的中間產(chǎn)物是美拉德反應(yīng)程度的基本指標(biāo)。MRPs的顏色是美拉德反應(yīng)程度的重要指標(biāo),可以定量反映產(chǎn)物顏色變化[12]。如圖1所示,添加多糖后,MRPs的吸光度均顯著提高,其中,CLPHM-FMP的褐變強(qiáng)度和中間體形成程度顯著高于CLPHM-IP和CLPHM-AP。CLPHM-FMP在420 nm和294 nm處吸光值分別為0.55和1.19,與CLPHM-FP相比,分別提高了67%和20%,這表明FMP可促進(jìn)中間產(chǎn)物和褐變產(chǎn)物的形成,進(jìn)而加深美拉德反應(yīng)的程度[13]。與CLPHM-FP相比,CLPHM-FMP的色度值L*顯著下降,表明產(chǎn)物亮度下降,FMP促進(jìn)了深褐色的化合物的形成,這與前文結(jié)果一致。

a-形成程度;b-色度值圖1 不同MRPs的形成程度和色度值分析Fig.1 Analysis of formation degree and chromaticity value of different MRPs注:不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.2 不同MRPs傅里葉紅外光譜分析

圖2 MRPs的傅里葉紅外光譜圖譜Fig.2 FTIR spectra of MRPs

2.3 不同多糖對(duì)MRPs風(fēng)味的影響

MRPs的風(fēng)味物質(zhì)一般主要包括醇類、酯類、醛類、酸類、烴類、酮類和雜環(huán)類化合物等。具體化合物詳情見(jiàn)電子版增強(qiáng)出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035333),經(jīng)過(guò)重復(fù)測(cè)定,在CLPHM-FP、CLPHM-IP、CLPHM-FMP和CLPHM-AP中分別檢測(cè)到103、110、98、90種揮發(fā)性化合物,主要的7類風(fēng)味物質(zhì)含量如圖3所示。與CLPHM-FP相比,加入多糖反應(yīng)后,醇類和雜環(huán)類化合物的含量增加較明顯,醛類化合物含量顯著下降。CLPHM-FMP中醇類和雜環(huán)類化合物的含量分別為357.42、357.86 μg/kg,增加了166.71%和53.37%,醛類化合物含量為147.17 μg/kg,下降了73.12%。其中,醇類化合物閾值較高,對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)相對(duì)較小[16],醛類物質(zhì)的氣味閾值一般較低,但對(duì)腥臭氣味有重要的影響[17],而雜環(huán)類化合物一般會(huì)帶來(lái)烤肉味、堅(jiān)果味,氣味閾值較低,對(duì)整體肉香味的形成具有重要貢獻(xiàn)[18]。

a-揮發(fā)性物質(zhì);b-雜環(huán)類化合物圖3 不同MRPs揮發(fā)性物質(zhì)及雜環(huán)類化合物含量Fig.3 Volatiles and heterocyclic compounds of different MRPs

OAV法結(jié)合揮發(fā)性化合物的含量和氣味閾值,用來(lái)評(píng)價(jià)揮發(fā)性化合物對(duì)樣品的香氣貢獻(xiàn)[19]。通常認(rèn)為OAV>1的化合物是對(duì)整體風(fēng)味有貢獻(xiàn)的關(guān)鍵香氣化合物,OAV>10的化合物是對(duì)整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的香氣化合物,OAV越大對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)值越大[20]。如表1所示,CLPHM-FP中正己醛、壬醛、4-甲基-5-(β-羥乙基)噻唑、反式-2,4-癸二烯醛和3-甲硫基丙醛的OAV>10,其中正己醛和壬醛是雞肝腥味的來(lái)源,3-甲硫基丙醛具有強(qiáng)烈的惡臭氣味[21],4-甲基-5-(β-羥乙基)噻唑具有腥臭味[22],而以上這些物質(zhì)在CLPHM-FMP中的OAV均有所降低,對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)減弱,表明腥味降低;CLPHM-FMP中2,3,5-三甲基吡嗪、2-甲基呋喃、2-正戊基呋喃和2-乙?；邕虻腛AV均大于10,風(fēng)味貢獻(xiàn)較大,其中2,3,5-三甲基吡嗪具有烤土豆香味,2-甲基呋喃具有巧克力香味[8],2-乙酰基噻唑具有爆米花和堅(jiān)果的香味[23],2-正戊基呋喃是低鹽發(fā)酵酸魚(yú)中的關(guān)鍵香氣化合物[24]。另外,2,6-二甲基吡嗪、芳樟醇、異丁醛和異戊醛在CLPHM-FP和CLPHM-FMP中的OAV均大于10,其中2,6-二甲基吡嗪具有烤堅(jiān)果香味,肉香味[8],芳樟醇具有花香韻味,異丁醛具有木質(zhì)香味,異戊醛具有酒香味,對(duì)MRPs的整體風(fēng)味均具有較大的貢獻(xiàn)。綜上所述,FMP可以減弱MRPs的腥味,增強(qiáng)其烘烤香味,對(duì)肉味形成具有重要貢獻(xiàn)作用。

2.4 不同多糖對(duì)美拉德反應(yīng)抗氧化性的影響

MRPs的還原能力可以將鐵離子還原為亞鐵離子,如圖4所示,與未添加多糖的CLPHM-FP相比,3種多糖MRPs的還原力均有所提高,其中CLPHM-FMP鐵離子還原力最高(0.52),提升了38%,CLPHM-FMP的DPPH自由基清除率為55.65%,提升了39%,其·OH清除率為34.07%,提升了23%。上述結(jié)果表明,添加FMP可以使CLPHM-FMP具有更強(qiáng)的抗氧化性,這可能是由于在420 nm處形成的褐變產(chǎn)物可以將大量類黑精所攜帶的陰離子電荷賦予MRPs,從而提高產(chǎn)物抗氧化能力[25]。

表1 MRPs中OAV≥1的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Key flavor substances with OAV≥ 1 in MRPs

2.5 CLPHM-FMP在素雞制備中的應(yīng)用

2.5.1 質(zhì)構(gòu)性能

按照1.2.7節(jié)的方法,將CLPHM-FMP應(yīng)用到素雞的制備中,利用物性分析儀對(duì)所制備的素雞的硬度、彈性、咀嚼性、黏性、凝聚性和恢復(fù)力進(jìn)行檢測(cè)。由表2可知,在素雞制備過(guò)程中加入CLPHM-FMP對(duì)其硬度、彈性、咀嚼性、黏性和凝聚性均無(wú)明顯影響(P≥0.05);另外,加入CLPHM-FMP可以提高素雞的恢復(fù)力。因此,CLPHM-FMP可有效保持素雞的質(zhì)構(gòu)性能。

表2 CLPHM-FMP對(duì)素雞質(zhì)構(gòu)性能的影響Table 2 Effects of CLPHM-FMP on textural performance of vegetarian chickens

2.5.2 風(fēng)味

利用GC-MS分析CLPHM-FMP對(duì)素雞揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響,如圖5所示。經(jīng)過(guò)重復(fù)檢測(cè),添加了CLPHM-FMP的素雞中共檢測(cè)到128種揮發(fā)性化合物,包括醇類27種、酚類3種、酯類7種、醛類17種、酸類4種、烴類51種、酮類8種、雜環(huán)類6種。峰面積代表?yè)]發(fā)性化合物含量,相比于無(wú)MRPs素雞,添加CLPHM-FMP后素雞的揮發(fā)性化合物總量提升了32.70%。CLPHM-FMP中烴類化合物、醇類化合物和雜環(huán)類化合物種類數(shù)分別增多了14種、5種和2種,含量分別提高了47.78%、35.69%和38.59%,烴類化合物是形成對(duì)肉味有貢獻(xiàn)作用的雜環(huán)化合物的重要中間體,對(duì)肉味形成具有基底作用[16],如CLPHM-FMP中形成的(-) -檸檬烯,氣味閾值低,OAV較大,被認(rèn)為是濃香型牛油特征風(fēng)味的重要來(lái)源[26],醇類化合物的風(fēng)味閾值取決于其飽和度[27],其中蘑菇醇含量提升了11.36%,OAV較大,是產(chǎn)生雞肉味的關(guān)鍵化合物[28],這兩類物質(zhì)的增加均有利于產(chǎn)品風(fēng)味的形成;雜環(huán)類化合物氣味閾值較低對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大,其中呋喃類化合物,如2-正戊基呋喃(含量提高了27%)和(Z)-2-(2-戊烯基)呋喃(含量提高了103%),是關(guān)鍵肉香味化合物[29-30]。以上結(jié)果說(shuō)明,素雞制備過(guò)程中添加CLPHM-FMP對(duì)素雞肉香味形成具有重要作用。

a-各類別揮發(fā)性化合物峰面積;b-各類揮發(fā)性化合物種類數(shù)圖5 素雞中的揮發(fā)性化合物分析Fig.5 Volatile compounds in vegetarian chicken

3 結(jié)論

本研究考察了不同多糖對(duì)雞肝酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味及抗氧化性的影響,并在素雞的制備中進(jìn)行了應(yīng)用探索。 結(jié)果表明,與不添加多糖相比,CLPHM-FMP在420 nm和294 nm處的吸光值分別為0.55和1.19,分別提高了67%和20%,亮度值L*為45.41,顯著降低了24%,表明FMP可促進(jìn)中間產(chǎn)物和褐變產(chǎn)物的形成。傅里葉紅外光譜顯示,CLPHM-FMP在酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶的峰吸收減弱,而在1 042 cm-1處峰的增強(qiáng),表明FMP的添加有助于在反應(yīng)中消耗氨基,且其多羥基糖鏈與雞肝酶解液結(jié)合程度最高。通過(guò)GC-MS分析發(fā)現(xiàn),CLPHM-FMP中雜環(huán)類化合物含量提高了53.37%,醛類化合物含量下降了73.12%,FMP可降低MRPs的腥味,對(duì)肉味形成貢獻(xiàn)作用較大。FMP可以提高其MRPs的抗氧化性能,Fe3+還原能力、DPPH自由基和·OH清除能力分別提高了38%、39%和23%。對(duì)素雞的物性分析結(jié)果顯示,CLPHM-FMP的添加可有效保持素雞的質(zhì)構(gòu)性能,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中烴類、醇類和雜環(huán)類化合物含量分別提升了52%、22%和38%,有助于素雞肉香味的形成。因此,FMP有利于雞肝酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味的形成及其抗氧化功能的提升,在風(fēng)味食品中具有較好的應(yīng)用前景。