酪蛋白膠束/聚乳酸靜電紡絲復合纖維膜性質及其對黃芩苷的負載性能研究

甄晨波,楊敏*,秦娟娟,鄭杰,廖海周,魏彥明,2*

1(甘肅農業大學 理學院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅農業大學 動物醫學院,甘肅 蘭州,730070)

黃芩苷(C21H18O11,baicalin,BCL)是從雙子葉植物黃芩(Scutellariabaicalensis)根部分離得到的一種黃酮類化合物,具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等多種藥理作用[1]。但由于BCL在水中的溶解度低,極大限制了其在食品及醫藥行業的應用。為了改善BCL的理化性質,眾多研究者將其制備成各種類型的制劑。CHEN等[2]將BCL和大豆磷脂共混后溶解于四氫呋喃中,隨后通過恒溫水浴回流和真空旋轉蒸發制得BCL/大豆磷脂復合物,相較于游離BCL,復合物對1型鴨甲肝病毒表現出更強的抑制作用。LI等[3]將BCL乙醇溶液和β-環糊精水溶液共混60 ℃攪拌24 h后,將得到的懸浮液冷卻至室溫后過濾,隨后將濾液冷凍干燥72 h,制備出BCL/β-環糊精包合物,顯著提高了BCL的溶出速率和溶解度,且BCL的相對口服生物利用度提高了2倍。可見,適宜的負載和包封有利于改善BCL的理化性質及生物利用度。然而,上述制劑制備過程多較為復雜。因此,有必要尋求一種簡單易行的技術,構建BCL的新制劑,改善其理化性質,擴大其應用范圍。

靜電紡絲技術是一種制備平均直徑在亞微米到納米范圍內超細纖維的新工藝。在此過程中聚合物溶液被置于可控電場中,當施加的電壓達到臨界值,斥力超過表面張力后,射流就會從溶液的表面噴射出來,當射流向接地的金屬收集器移動時,溶劑蒸發,超細干燥纖維沉積[4]。靜電紡絲具有簡單易行、制備率較高、成本低、纖維性能可控等獨特優點;靜電紡絲納米纖維具有纖維直徑小、比表面積大、孔隙率高等特點[5];可對功能因子進行負載和可控制釋放,提高功能因子的溶出率[6]。YANG等[7]利用靜電紡絲技術制備了聚乙烯醇/乙基纖維素/茶多酚復合納米纖維膜,該纖維膜具有較好耐水性和水蒸氣阻隔性能,且表現出良好的抗氧化和抗菌活性,可使豬肉的貨架期延長3 d。

雖然目前的靜電紡絲基料主要集中在合成聚合物上,但天然生物聚合物具有可再生和可持續的優異特性,使得基于天然聚合物的纖維具有極好的生物相容性和可降解性。因此蛋白質等天然聚合物成為靜電紡絲的新型理想基料。

酪蛋白是牛奶中含量最高的蛋白質,由αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白4部分組成,占牛奶蛋白的80%;其價格低廉,易于獲得,可生物降解,并且具有較高的營養價值。天然狀態的酪蛋白與鈣結合并組裝成一種獨特的膠束結構,稱為酪蛋白膠束(casein micelle,MC),其粒徑范圍為50～600 nm,平均粒徑為150 nm[8]。MC具有內部疏水、表面親水的特殊結構,是負載活性分子的優良基質。已有研究表明,MC可作為咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、原花青素的良好載體,用于改善活性因子的理化性質和抗氧化性[9-10]。然而,目前以MC為基質,通過靜電紡絲技術制備纖維膜,以負載活性因子的研究報道較少。

聚乳酸(poly lactic acid,PLA)是一種脂肪族熱塑性聚酯,由玉米、土豆等可再生資源生產,具有安全性高、機械性能好、成本低等優點;并且具有良好的生物相容性和生物可降解性,是一種已被美國食品和藥物管理局批準的醫用輔料[11-12]。近年來,PLA已被廣泛用作靜電紡絲基料,用于負載活性因子。有報道利用靜電紡絲PLA纖維負載香芹酚,實現了香芹酚的控釋[13]。另外,采用靜電紡絲技術制備的PLA/絲素蛋白納米纖維用于負載扶他林,可對扶他林進行控釋,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現出良好的抑制效果[14]。但是,將PLA和MC共混制備靜電紡絲纖維并進行生物活性分子的負載研究報道較少。

本文以PLA和MC為基料,采用靜電紡絲技術制備出負載BCL的復合纖維膜;采用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared,FTIR)、掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)等手段表征了復合纖維膜的結構,進而分析了復合纖維膜的理化性質,并評價了復合纖維膜中BCL的釋放特性。研究結果不僅可為BCL的負載提供技術依據,而且可為拓寬MC和PLA的應用領域提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芩苷、聚乳酸、六氟異丙醇,上海麥克林生化科技有限公司,其他試劑均為分析純。酪蛋白膠束,實驗室自制,總蛋白質含量為(83.26±1.87)%(質量分數)。

1.2 設備

Nicolet iS50型FTIR光譜儀,美國賽默飛世爾科學公司;XD3型X射線多晶衍射儀,北京普析通用儀器有限責任公司;STA 449 F5型TG-DSC熱分析儀,德國耐馳儀器制造有限公司;UV-1780雙光束紫外可見分光光度計,島津儀器有限公司;HP-200精密色差儀,河南兄弟儀器設備有限公司;E05靜電紡絲機,佛山輕子精密測控技術有限公司;CA200自動型光學接觸角測量儀,廣東北斗精密儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紡絲共混溶液的制備

稱取適量的MC溶解于六氟異丙醇中,準確稱取80 mg的BCL,溶于六氟異丙醇中制成質量濃度為10 mg/mL的溶液。將8 mL的BCL溶液加入8 mL MC溶液中,37 ℃下磁力攪拌1 h。在上述溶液中加入適量的PLA,繼續攪拌4 h后得到MC和PLA質量比為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的靜電紡絲共混溶液(所有比例下MC和PLA總質量為2.56 g)。以不含MC的共混液作為對照。

1.3.2 靜電紡絲纖維膜制備

將配制好的MC/PLA/BCL共混溶液吸入10 mL注射器中,配備20 G鋼針,安裝于注射泵上,采用靜電紡絲機進行纖維膜制備。紡絲速度1.0 mL/h,電壓19 kV,針尖-滾筒接收間距12.5 cm,滾筒轉速120 r/min,紡絲溫度25 ℃。將收集的纖維膜置于密封袋中,備用。

1.3.3 SEM表征

將纖維膜置于導電硅膠上,噴金后采用S-3400 N掃描電子顯微鏡觀察表面形貌。

1.3.4 FTIR分析

將纖維膜樣品置于衰減全反射元件上,設置光譜分辨率為4 cm-1,掃描32次,記錄樣品在400～4 000 cm-1的紅外光譜。

1.3.5 X射線衍射(x-ray diffraction,XRD)分析

采用X射線單晶衍射儀在Cu Kα輻射下對纖維膜進行XRD掃描。

1.3.6 差示掃描量熱-熱重(differential scanning calorimetry-thermogravimetry,DSC-TG)分析

用DSC-TG熱分析儀測定樣品的熱分解特性。準確稱取6～8 mg樣品,置于Al2O3坩鍋中,以10 ℃/min的升溫速率從30 ℃加熱至500 ℃,用空坩堝作空白對照。

1.3.7 色度分析

使用精密色差儀對樣品色度進行測量,顏色結果表示為L*(亮度),a*(紅度),b*(黃度)。樣品色差ΔE的計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.8 接觸角測定

將纖維膜裁剪成2 cm×2 cm的矩形,利用接觸角儀測量其水接觸角,評價復合纖維膜的疏水性。

1.3.9 溶脹性和降解性

參考GHORBANI等[15]的方法對復合纖維膜的溶脹性和降解性進行測定,略有修改。

溶脹性的測定:將纖維膜裁剪成2 cm×2 cm的矩形并稱重。隨后,將纖維膜浸泡在25 ℃、0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中,分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24 h時將纖維膜從緩沖液中取出,用吸水紙去除表面水分,稱重。溶脹性計算如公式(2)所示:

(2)

式中:m0,纖維膜初始質量,g;mt,纖維膜各時間點溶脹后的質量,g。

降解性的測定:將纖維裁剪成2 cm×2 cm的矩形并稱重。隨后,將纖維膜在25 ℃、0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡48 h。然后,將未溶纖維膜小心取出,在60 ℃下干燥48 h,稱重。降解性計算如公式(3)所示:

(3)

式中:m0,纖維膜初始質量,g;m,纖維膜浸泡48 h后剩余質量,g。

1.3.10 黃芩苷的體外釋放分析

參考TAN等[16]的方法分析纖維膜中BCL的體外釋放特性,略有修改。準確稱取100 mg樣品,置于具塞錐形瓶中。加入50 mL 0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液,于37 ℃、130 r/min下恒溫振蕩。分別在設定時間點取3 mL溶液,同時補充3 mL緩沖溶液。使用紫外-可見分光光度計在360 nm處測定釋放液的吸光度,利用同條件下BCL的標準曲線(y=33.506 74x,R2=0.999 96)計算BCL累積釋放率。

(4)

式中:ρ0,樣品中BCL總質量濃度,mg/mL;ρt,t時刻時釋放的BCL質量濃度,mg/mL。

1.4 數據統計分析

所有試驗重復3次,試驗數據采用Excel 2010處理并用平均數±標準偏差表示,用Origin Pro 9.0作圖,用SPSS 22進行差異顯著性分析,數據間差異顯著分析采用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 復合纖維膜的微觀形貌觀察

如圖1所示,游離BCL和凍干MC為片層狀結構。PLA纖維膜為均勻纖維狀結構,直徑為1～1.5 μm。添加BCL使PLA纖維出現輕微的卷曲現象,且直徑略有增大。這可能是由于BCL與PLA產生相互作用,在PLA分子鏈間形成了交聯作用,進而改變了紡絲溶液的黏度,使紡絲溶液在靜電紡絲過程中無法充分拉伸,造成了纖維伸展性降低,與SUN等[17]的研究結果一致。隨著MC添加比例在0∶1到1∶1范圍內的升高,纖維的整體有序性、均勻性和成纖性逐漸變差,且纖維直徑減小,并出現輕微的珠狀結構。當MC的添加量進一步增加到與PLA的比例為1∶1時,纖維直徑進一步減小,并出現較大的珠狀結構。這是因為隨著MC添加量的增加,紡絲溶液的黏度降低,共混物中的分子鏈纏結不足,使其成纖能力下降,紡絲過程中出現靜電噴涂現象,產生較大的珠狀結構,并使纖維的均勻度下降。BIRANJE等[18]在此前研究中也發現隨著酪蛋白添加量的增加,酪蛋白/聚乙烯醇纖維中珠狀結構也隨之增大。

圖1 復合纖維膜SEM圖Fig.1 SEM images of composite fiber membranes注:0∶1、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1代表MC和PLA的質量比; 80代表BCL的添加量為80 mg。

研究指出,PLA溶液的流動行為指數小于1,表現為非牛頓剪切稀化行為,這種特性可以增加聚合物鏈的纏結,進而使靜電紡絲纖維直徑增大[19-20]。另一方面,MC粒徑小于PLA分子鏈的長度,隨著PLA比例的減小,紡絲溶液中的鏈纏結下降,因此復合纖維直徑減小。當MC與PLA質量比進一步增加到2∶1和3∶1時,纖維直徑不再減小,約為0.5 μm。這可能是由于MC添加量進一步增大,MC粒子間相互作用增強,通過相互作用形成了穩定的紡絲溶液。可見,MC與PLA質量比為2∶1時具有較好的成纖性能,可通過調節MC和PLA的比例實現對纖維直徑的調控。

2.2 復合纖維膜的FTIR分析

圖2 復合纖維膜FTIR圖Fig.2 FTIR images of composite fiber membranes

2.3 復合纖維膜的XRD分析

如圖3所示,MC和PLA均出現較寬的峰,說明二者均呈現無定形結構。BCL在12.48°、14.76°、17.08°、21.38°、23.80°、25.52°、28.12°和34.88°處出現特征晶體衍射峰,表明BCL為晶體形態[21]。然而,PLA/BCL和MC/PLA/BCL纖維膜中BCL的特征衍射峰消失,表明BCL被PLA和MC/PLA完全包封,這與FTIR研究結果一致。在MC/PLA/BCL纖維膜中出現MC的衍射峰,但強度小于單一MC的強度,并且輕微左移,這可能是因為PLA的加入改變了原溶液的性質,且產生了非共價相互作用。

圖3 復合纖維膜XRD圖Fig.3 XRD images of composite fiber membranes

2.4 復合纖維膜的熱分解特性分析

由圖4-a可知,BCL在221 ℃附近出現熔融吸收峰;PLA纖維膜在66 ℃附近出現吸收峰,為PLA的玻璃化轉變溫度[22],且在170 ℃附近出現熔融吸收峰。PLA/BCL和MC/PLA/BCL復合纖維膜表現出與PLA相似的DSC曲線,這是因為復合纖維膜具有相似的結構。但在MC/PLA/BCL復合纖維膜中PLA的玻璃化轉變溫度略有降低,這可能是因為BCL和MC的加入使PLA在靜電紡絲過程中改變了聚合物分子鏈的排列,打亂了PLA原有分子鏈的排列規則。HAN等[23]研究發現,茶多酚和肉桂醛的加入使聚乳酸纖維膜的玻璃化轉化溫度略有降低,與本文研究結果一致。

a-DSC曲線;b-TG曲線圖4 復合纖維膜DSC-TG曲線Fig.4 DSC-TG curves of composite fiber membranes

如圖4-b所示,MC和BCL分別在270～410 ℃和200～350 ℃失重,表明分子熱分解。PLA纖維膜在260～360 ℃出現較大的質量損失,由PLA鏈斷裂所致[24]。所有纖維膜均在60 ℃開始失重,這是由于溶劑蒸發所致。與PLA纖維膜相比,PLA/BCL纖維膜開始失重的溫度升高,表明BCL的添加增強了PLA纖維膜的熱穩定性。與PLA/BCL纖維膜相比,MC/PLA/BCL纖維膜表現出更高的質量保留率,表明MC的添加進一步提高了復合纖維膜的熱穩定性。這是因為添加MC后,MC與PLA之間可產生非共價相互作用,且MC粒子之間存在相互作用,從而使纖維膜的熱穩定性進一步增強。AYDOGDU等[25]研究發現,添加大豆蛋白降低了聚環氧乙烷/羥丙甲纖維素纖維膜的質量損失,增強了復合纖維膜的熱穩定性,與本文的研究結果一致。

2.5 復合纖維膜的水接觸角和色度分析

由圖5和表1可知,PLA膜疏水性較強,是一種典型的疏水材料[26]。所有纖維膜的水接觸角均大于90°,表現出明顯的疏水特性。BCL對單一PLA纖維膜的水接觸角影響不大,這可能是因為BCL添加量較少,且被完全包封在纖維中。隨著MC的添加,復合纖維膜的水接觸角逐漸減小。這可能是因為隨著MC比例的增加,纖維外層的MC增加,使其疏水性下降。另一方面,隨著MC添加比例的增大,纖維直徑減小,纖維排列成膜時的間隙增加,水接觸角減小。有研究表明,纖維直徑越小,孔隙率越高,吸水率增大,接觸角減小[27]。

圖5 復合纖維膜水接觸角圖Fig.5 Water contact angle diagram of composite fiber membranes

色度方面,負載BCL的復合膜亮度值L*為93～95,表現出一定的黃色度,這是由于BCL呈現黃色度所致。隨著MC添加比例的增大,復合膜的a*值逐漸減小,b*值基本呈現增大的趨勢。可見,MC的添加降低了BCL的紅色度;且因其呈現乳黃色,因此增加了復合纖維膜的黃色度。

表1 復合纖維膜的接觸角及色度Table 1 Water contact angle and chromaticity of composite fiber membranes

2.6 復合纖維膜的降解性分析

如圖6所示,PLA纖維膜和PLA/BCL纖維膜在48 h內的降解率均低于8%,負載BCL對PLA纖維膜的降解率影響不大。PLA作為一種典型的疏水材料,其在水中降解性較差。隨著MC添加比例在0∶1～1∶1增加,纖維膜的降解率明顯增大,這是因為MC增加了纖維膜的溶解性。但當MC比例進一步增加到2∶1和3∶1后,纖維膜的降解率隨MC添加量的增加變化不顯著(P<0.05),這可能是因為當MC/PLA的比例超過1∶1后,復合纖維膜由PLA包覆MC型轉變為MC包覆PLA型,因此MC的添加量增加對復合纖維膜降解率影響不大。另外,在MC與PLA的比例為0∶1～2∶1,復合纖維膜的降解率隨MC添加量的增加呈線性增大。可見,可通過添加MC以調節PLA纖維膜的降解率。

圖6 復合纖維膜降解率Fig.6 Degradation rate of composite fiber membranes

2.7 復合纖維膜的溶脹性分析

由圖7和表2可知,PLA纖維膜和PLA/BCL纖維膜在24 h的溶脹率只有(9.25±1.05)%和(8.82±0.62)%。添加一定量MC后,纖維膜的溶脹性迅速增大,這是因為MC為水溶性多孔粒子,具有較高的水合性;且隨著MC的添加,纖維直徑減小,纖維間孔隙增大,吸水性增強。MC與PLA比例為1∶3的復合纖維膜溶脹性最好,在2 h達到最大溶脹率(228.28±3.95)%。之后,隨著MC添加量的進一步增大,復合纖維膜最大溶脹率逐漸降低,達到最大溶脹率的時間也有所減少。這是因為MC是水溶性分子,其在水中溶解,使膜的質量降低所致,與LIU等[28]的研究結果相似。

圖7 復合纖維膜溶脹性Fig.7 Swelling rate of composite fiber membranes

表2 復合纖維膜最大溶脹率及最大溶脹時間Table 2 Maximum swelling rate and its time of composite fiber membranes

2.8 復合纖維膜中BCL的體外釋放性分析

如圖8所示,游離BCL在緩沖液中迅速釋放,且隨著時間的延長釋放率降低,說明其發生了輕度降解,與已有報道類似[29]。由于PLA為疏水性分子,經PLA負載后,BCL釋放率極低。在MC/PLA/BCL復合纖維膜中,BCL在2 h內迅速釋放,之后釋放率迅速減緩,并在3 h后維持穩定。由于MC水溶性較好,其添加量越多,BCL釋放率越高。包封在玉米醇溶蛋白纖維中的姜黃素也表現出10 min內爆發性釋放的特性,與本文研究結果類似[30]。由此可見,添加MC有利于增加BCL從PLA纖維膜中的釋放率。

圖8 復合纖維膜中BCL釋放率曲線Fig.8 Profiles of BCL release rate from composite fiber membranes

3 結論

以PLA和MC為基質,采用靜電紡絲技術制備了復合纖維膜,實現了BCL的負載。當MC與PLA質量比達到2∶1后,復合纖維具有較規則的形貌,且直徑較小。添加MC改善了PLA纖維膜的疏水性,提高了其溶脹率,且增加了BCL的釋放率。另外,MC的添加降低了纖維膜的紅色度,增加了黃色度,改善了顏色。經MC/PLA復合纖維膜負載后,減緩了BCL的釋放率。