高能電子束輻照對黃精微生物及品質的影響

徐攀,許競地,陳謙,邱婭璐,高鵬*

1(四川省原子能研究院,四川 成都,610101)2(輻照保藏四川省重點實驗室,四川 成都,610101)

黃精(Polygonatirhizoma)又名雞頭黃精、白及、姜形黃精等,是百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatimill)植物的干燥根莖?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版記載了滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)、黃精(PolygonatumsibiricumRedoute)和多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)3種黃精藥材[1]?，F代藥理學研究表明,黃精主要含多糖、甾體皂苷、黃酮、生物堿、蒽醌類化合物及微量元素[2],在抗腫瘤、抗阿爾茲海默癥、調節免疫力、降血脂降血糖、保護心臟等方面有較高的藥用價值[3]。另外,黃精是一種典型的藥食同源產品,已有許多深加工產品,如黃精酒、黃精餅干及黃精饅頭等,其嫩葉和莖也可作為蔬菜食用[4]?，F黃精已廣泛應用于食品、藥品、化妝品等領域。

中藥材的質量影響其療效,對中藥材進行合理的貯藏養護,能夠更好的保護藥效,避免藥性流失,對提高臨床療效及用藥安全性均有重要意義。黃精含糖量高、肉性足、香味濃,炮制后不易干燥,在貯藏中易出現霉變、腐爛、蟲蛀等變質現象。對此類藥材多采用簡單的避光、密閉法進行養護,但貯藏效果差。此外,還有低溫冷藏、除氧保鮮、氣調貯藏等技術進行養護[5-6],但成本較高。輻照保藏是一種“冷殺菌”技術,其穿透力強、滅菌徹底,適合揮發性、熱敏性中藥的大批量滅菌[7],能有效減少中藥材微生物含量,同時能最大限度的保持中藥材的性狀及藥理活性[8]。研究發現60Co-γ輻照處理黃精可使微生物含量顯著減少[9]。除60Co-γ射線外,電子加速器在近幾年也運用于中藥材保藏[10]。相比γ射線,電子束輻照無需處理放射性廢源、加工能力更強、速度更快,在食品貯藏、材料改性等方面均有廣泛應用[11-12]。安全、高效、經濟的電子束輻照逐步替代60Co-γ射線,成為輻照加工行業主要的發展方向。

目前,研究較多的是60Co-γ輻照處理中藥材,關于電子束輻照技術在黃精的應用研究鮮見報道,電子束輻照對黃精微生物殺菌效果及品質的影響還未知。本研究以黃精為試驗材料,采用高能電子束輻照處理,評估不同劑量輻照對黃精微生物含量及品質的影響,以期為后續電子束輻照殺菌用于黃精貯藏提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精購于成都市金牛區荷花池中藥材專業市場,淡黃色、片狀,厚度約0.2 cm,經西南科技大學侯大斌教授鑒定為黃精(P.sibiricumRedoute)。

NaCl蛋白胨緩沖液(pH 7.0)、胰酪大豆胨液體/瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、腸道增菌液體培養基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基、麥康凱液體/瓊脂培養基、RV沙門增菌液培養基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基,青島高科技工業園海博生物技術有限公司;重鉻酸銀劑量計,自制,校準標準為JJG 1028—1991《使用重鉻酸銀劑量計測量γ射線水吸收劑量標準方法》。

1.2 儀器與方法

SX-500高壓滅菌鍋,日本Tom Digital Biology公司;CJ-1450超凈工作臺,蘇信環境科技有限公司;PJ-400拍打式無菌均質機,力辰科技公司;ZWY-211C智能全溫振蕩器,常州金壇精達儀器制造有限公司;TH-02-260B電熱恒溫鼓風干燥箱,成都易華天宇實驗設備有限責任公司;CS-C600色差儀,杭州彩譜科技有限公司;PEN3電子鼻,德國AIRSNSE公司;GJ-2高能電子加速器,四川潤祥輻照技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 輻照處理

黃精采用20 cm×14 cm聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)/聚乙烯(polyethylene,PE)復合袋包裝,每袋80 g,平鋪厚度約2 cm,采用高能電子加速器(能量10 MeV,功率20 kW)進行單面輻照,設定劑量2、4、6、8、10 kGy,未輻照樣品為對照(CK)。重鉻酸銀劑量測定樣品的實際吸收劑量,為1.8、3.7、6.3、7.8、10.1 kGy。下文以設定劑量表示。

1.3.2 微生物檢測

需氧菌總數、霉菌和酵母總數、耐熱菌總數、耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌及沙門菌按《中華人民共和國藥典》2020版(4部)1108中藥飲片微生物限度檢查法進行檢測[1]。

1.3.3 理化品質測定

黃精水分、總灰分及浸出物按《中華人民共和國藥典》2020版(4部)中的方法測定[1]。其中水分含量按照通則0832第四法,總灰分按照通則2302,浸出物按照通則2201下的醇溶性熱浸法。

1.3.4 色差測定

黃精60 ℃烘干、粉碎,過40目篩,使用色度儀測定其L*、a*、b*值。根據公式(1)計算飽和度C,根據公式(2)計算總色差ΔE,根據公式(3)計算色度指標變異系數(coefficient of variation,CV)[10]。

(1)

(2)

(3)

式中:ΔL*、Δa*、Δb*為輻照處理組與對照組的差值,SD為標準偏差,MN為平均值。

1.3.5 揮發性物質測定

取1.00 g黃精粉置于15 mL頂空瓶中,室溫放置2 h。在室溫下插入E-nose探頭吸取頂端空氣進行測定。測試載氣為空氣,氣體流量為400 mL/min,檢測時間90 s,自動清洗時間90 s。電子鼻各傳感器特點見表1。

表1 PEN3型便攜式電子鼻傳感器性能描述Table 1 Performance description of REN3 portable electronic nose sensor

1.3.6 數據分析

數據采用SPSS 23.0統計軟件進行LSD及Duncan顯著差異性(P<0.05)分析;采用Origin 21.0進行繪圖;電子鼻數據使用系統自帶軟件Winmuster進行分析。

2 結果與分析

2.1 對微生物含量的影響

根據《中華人民共和國藥典》2020版1107非無菌藥品微生物限度標準,非無菌藥用原料及輔料的需氧菌總數限度為103CFU/g,霉菌和酵母菌總數限度為102CFU/g,控制菌未做統一要求[1]。由表2可知,CK組中需氧菌總數為2.9×103CFU/g,霉菌和酵母菌總數為4×102CFU/g,不符合藥典標準。當黃精經過2 kGy劑量輻照,需氧菌總數降為5×102CFU/g,霉菌和酵母菌總數降為20 CFU/g,達到藥典規定的限度標準。雖然藥典中對耐熱菌和耐膽鹽革蘭氏陰性菌未做要求,但經過4 kGy劑量輻照,可完全殺滅黃精中的這兩類微生物。經過6 kGy劑量輻照,只有少量的需氧菌存活。當輻照劑量達到8 kGy,微生物總數均降至檢測限(10 CFU/g)以下。此外,大腸埃希氏菌和沙門氏菌均未檢出。

表2 電子束輻照對黃精微生物數量的影響Table 2 Effect of electron beam irradiation on the microbial load in P. sibiricum Redoute

輻照滅菌是利用γ射線、X射線或電子束照射物品,通過直接或間接的作用引起微生物DNA、蛋白質、脂類等有機大分子發生斷裂、交聯、降解,從而導致微生物死亡[13]。不同種類的微生物對輻照的耐受能力不同,甚至同屬、同種的不同菌株間也存在差異。從食品和藥材中常有的微生物種類來看,耐輻射性依次為芽胞菌>酵母菌>霉菌>革蘭氏陽性菌>革蘭氏陰性菌[14-15]。微生物數量越多,殺滅需要的輻照劑量越高。同時,相關研究表明輻照殺菌效果與射線種類、放射源強度、電子束束能、微生物負載基質、輻照溫度、包裝的氣體狀態等有關[16]。

有研究表明,黃精經60CO-γ射線輻照后,微生物數量顯著減少,并隨輻照劑量增加更明顯[9];黃芩和南星經5.0 kGy劑量60CO-γ輻照后能達到衛生學標準要求[17]。何毅等[10]采用電子束輻照處理川麥冬,結果表明電子束能明顯降低麥冬中需氧菌、酵母及霉菌總數;付孟等[18]采用電子束輻照大黃,發現3～5 kGy及以上劑量輻照使大黃微生物數量降至檢測限以下。因此,電子束輻照與60CO-γ輻照效果一致,均能有效殺滅中藥材中的微生物,且隨著輻照劑量的增加抑菌效果增強。

2.2 對理化品質的影響

根據《中華人民共和國藥典》2020版規定黃精水分不得超過18%,總灰分不得超過4%,浸出物不得少于45%,輻照前后的黃精均符合藥典規定[1]。由表3可知,不同劑量輻照處理黃精水分含量在17.08%～17.23%,總灰分含量在2.40%～2.50%,均無顯著差異(P>0.05)。浸出物含量在49.75%～58.25%,在2 kGy劑量下對浸出物含量無顯著影響(P>0.05);當輻照劑量≥4 kGy時,可顯著增加浸出物含量(P<0.05),在8 kGy處理組最多,相比CK組,提高17.08%。

表3 電子束輻照對黃精水分、總灰分及浸出物含量的影響Table 3 Effect of electron beam irradiation on moisture, total ash and extracts of P. sibiricum Redoute

本研究發現電子束輻照處理不會影響黃精水分和總灰分含量,與何毅等[10]、付孟等[18]研究結果一致。付孟等[18]在對大黃進行電子束輻照處理,發現輻照可使水溶性浸出物顯著增加。相關研究表明,淀粉經60CO-γ輻照處理,分子鏈斷裂、聚合度降低、分子質量變小[19],電離輻射會使肌肉蛋白質水解形成多肽[20]。此外,輻照可導致總黃酮與單個或數個糖分子結合產物的糖苷鍵斷裂產生黃酮苷或黃酮苷元[21]。本研究發現輻照可使黃精浸出物顯著增加,推測其原因是輻照后蛋白質、多糖等大分子發生降解,產生如寡糖、有機酸、多肽等,使得其更容易浸出。

2.3 對色澤的影響

由表4可知,在10 kGy劑量范圍內,輻照不會對黃精的亮度值及紅綠值產生顯著影響(P>0.05)。在4 kGy劑量范圍內,輻照對黃精的黃藍值和飽和度無顯著影響(P>0.05);當輻照劑量達到6 kGy時,會顯著增加其黃藍值和飽和度(P<0.05)。從變異系數來看,黃精的色度變異系數大小依次為b*值>飽和度C>a*值>L*值,表明電子束輻照對黃精的色澤主要影響在黃藍值b*上。ΔE值越大說明色澤變化越大,ΔE值<6.0時色差不明顯;6.0～12.0時色差較大;>12.0時為不同顏色[22]。ΔE<6.0,表明在10 kGy劑量范圍內電子束輻照不會對黃精總色差產生明顯影響。

表4 電子束輻照對黃精色澤的影響Table 4 Effect of electron beam irradiation on color of P. sibiricum Redoute

2.4 對揮發性成分的影響

2.4.1 雷達圖分析

電子鼻是利用氣體傳感器的響應值來識別氣味,同時結合多元統計學方法獲取樣品中揮發性物質的完整信息[23]。提取10個傳感器的特征值,選擇60～62 s的數值繪制雷達指紋圖,結果見圖1。所有處理組W1W傳感器信號最強,其次為W2W和W5C,然后是W1S,表明黃精氣味中的主要物質為硫化物、芳香類物質、氮氧化合物及甲烷,且輻照后黃精主要揮發性成分未發生改變。

CK組和輻照組在W2W、W5C、W1S、W2S四個傳感器中有差別。在W2W傳感器中,隨著輻照劑量的增加響應值增大,表明輻照會促進黃精芳香成分的揮發;在W5C傳感器中,輻照劑量≥6 kGy時響應值增大,表明當輻照劑量達到6 kGy會促進黃精氮氧化合物揮發;在W1S傳感器中,輻照劑量≥4 kGy時響應值增加,表明當輻照劑量超過4 kGy會增加黃精揮發性成分中甲烷物質含量;在W2S傳感器中,輻照劑量≥6 kGy時響應值增大,表明當輻照劑量達到6 kGy會增加黃精揮發性成分中醇類、醛酮類化合物含量。

樊萍等[24]在對輻照面包異常氣味研究中發現輻照會使芳香族烴類含量顯著增加;舒曉燕等[23]研究輻照對白芷揮發性成分的影響中發現輻照會增加甲烷類物質;有關研究表明輻照可使酯類物質轉化為醛酮類,此類物質可引起“輻照味”,其含量越高輻照味越濃[25-26]。本實驗結果結合前人研究,發現輻照會導致中藥材等某些揮發性成分增加。

2.4.2 主成分分析(principal component analysis, PCA)

PCA是一種數據降維處理的方式,通過提取幾個主成分因子來代表原始樣本的變量,然后根據主成分因子在不同樣本中的貢獻率來評價樣本間的規律性和差異性[27]。選取60～62 s數值,使用電子鼻自帶系統進行PCA,結果見圖2。第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為85.55%和12.71%,總貢獻率為98.26%,可以較好的反應輻照前后黃精的揮發性氣味全部特征信息。CK組和2 kGy處理組有交互,表明樣品相似度高;8 kGy處理組和10 kGy處理組也有交叉,說明樣品相似度高。同時6 kGy處理組與8～10 kGy處理在第一主成分距離較短,因此需要進一步探究不同樣品揮發性物質的區別。

圖2 不同劑量輻照處理后黃精氣味PCA圖Fig.2 Principal component analysis (PCA) of P. sibiricum Redoute odor after different irradiation dose

2.4.3 線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)

LDA是一種經典的有監督數據降維方法,可使相同類別聚在一起,不同類別之間相距較遠,能更好的顯示樣品間的差異[28]。選取60～62 s數值,使用電子鼻自帶系統進行LDA,結果見圖3。

圖3 不同劑量輻照處理后黃精氣味LDA圖Fig.3 Linear discriminant analysis (LDA) of P. sibiricum Redoute odor after different irradiation dose

圖3中,第一主成分貢獻率91.15%,第二主成分貢獻率3.25%,總貢獻率94.40%,可以很好的區分不同樣品。在第一象限,CK組和2 kGy處理組聚在一起,4～10 kGy處理組聚在一起,說明CK組和2 kGy處理組揮發性物質相似,4～10 kGy處理組揮發性物質相似,即在2 kGy輻照劑量下對黃精氣味無明顯影響。

3 總結

黃精經2 kGy以上劑量電子束輻照處理,可有效殺滅微生物,同時對其水分和總灰度含量無顯著影響,當輻照劑量達到4 kGy可顯著增加浸出物含量。在10 kGy劑量范圍內,不會對黃精色澤產生明顯影響,不會對黃精主要揮發性產生影響,但會影響芳香成分、氮氧化合物、甲烷物質及醇類、醛酮類化合物等物質揮發性。