小白鏈霉菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-聚賴氨酸的體系構(gòu)建與優(yōu)化

朱道君,刁文嬌,張佳微,王靚,張宏建,張建華,陳旭升*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是25～35個(gè)L-賴氨酸單體通過α—COOH和ε—NH2縮合形成的一種天然抗菌肽[1]。因其具有廣譜抑菌性,在食品防腐領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用[2]。另外,它也同樣活躍于藥物載體、基因載體和新材料等領(lǐng)域,具有廣泛的應(yīng)用前景[3]。

ε-PL目前通過小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)好氧發(fā)酵進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。以往研究表明,通過發(fā)酵過程優(yōu)化與調(diào)控是提升ε-PL生產(chǎn)效率的有效方法。例如,KAHAR等[4]建立了一種分階段pH值調(diào)控策略,在5 L發(fā)酵罐的補(bǔ)料分批發(fā)酵中實(shí)現(xiàn)S.albulusS410的ε-PL產(chǎn)量達(dá)到48.30 g/L。REN等[5]提出了一種利用pH沖擊提高ε-PL發(fā)酵水平的策略,實(shí)現(xiàn)5 L發(fā)酵罐ε-PL產(chǎn)量達(dá)到54.70 g/L;另外,WANG等[6]利用新選育的高產(chǎn)突變株S.albulusR6,采用pH沖擊工藝,實(shí)現(xiàn)ε-PL產(chǎn)量突破70.00 g/L。盡管上述發(fā)酵策略實(shí)現(xiàn)ε-PL產(chǎn)量大幅提升,但存在底物(葡萄糖或甘油)轉(zhuǎn)化率低(10%左右)的問題。利用葡萄糖或甘油做碳源從頭合成ε-PL約需要26步胞內(nèi)生化反應(yīng)以及眾多支路代謝,這可能是轉(zhuǎn)化率低的重要原因。L-賴氨酸是ε-PL合成前體[7],若能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化外源L-賴氨酸合成ε-PL將有望解決轉(zhuǎn)化率低的問題,目前尚未見報(bào)道。然而,眾多研究者探究了外源L-賴氨酸添加對ε-PL發(fā)酵的影響。例如,HIROHARA等[8]在培養(yǎng)基中添加11 mmol/LL-賴氨酸可使S.lydicusUSE-11的ε-PL產(chǎn)量提升約12.5%,而對Streptomyscessp.USE-51則沒有效果。LIU等[9]在培養(yǎng)基中添加3 mmol/LL-賴氨酸使得StreptomycesahygroscopicusGIM8的ε-PL產(chǎn)量從0.78 g/L 提升到1.16 g/L,但L-賴氨酸消耗較小,僅約為2.0 mmol/L(約0.29 g/L)。LI等[10]也發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加1.00 g/LL-賴氨酸可使Streptomycesdiastatochromogenes6#-7的ε-PL產(chǎn)量提升49.0%。本團(tuán)隊(duì)CHEN等[11]在搖瓶中添加2.00 g/LL-賴氨酸使得S.albulusM-Z18的ε-PL產(chǎn)量提升105%,但L-賴氨酸的消耗僅約為0.9 g/L;在5 L發(fā)酵罐的補(bǔ)料分批發(fā)酵中,從72 h維持1 g/LL-賴氨酸使得ε-PL產(chǎn)量達(dá)到37.60 g/L,較對照提升了6.2%。上述研究結(jié)果表明,發(fā)酵過程中添加外源L-賴氨酸對大部分的ε-PL生產(chǎn)菌有積極作用,但均存在L-賴氨酸利用量低(<2.0 g/L)或ε-PL產(chǎn)量提升不顯著(<10%)的問題,說明通過在發(fā)酵體系中直接添加L-賴氨酸對提升ε-PL生產(chǎn)效率作用有限。

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是一種利用菌體細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行催化的生物合成方法,其本質(zhì)仍是胞內(nèi)酶的催化作用。與純酶催化相比,全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)成本低且擁有完整的酶體系,可在降低生產(chǎn)成本的同時(shí)提高催化效率,已被廣泛應(yīng)用于(R)-檸蘋酸[12]、膽綠素[13]、D-甘露醇[14]等眾多生物制品的生產(chǎn)?；诖?本文以一株ε-PL工業(yè)生產(chǎn)菌株S.albulusGS114為研究對象,提出了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)ε-PL的新方法,并對轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基和條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化,在最優(yōu)體系中實(shí)現(xiàn)了S.albulusGS114轉(zhuǎn)化L-賴氨酸大量合成ε-PL。同時(shí),借助合成生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建了攜帶L-賴氨酸特異性通透蛋白基因lysp[15]的工程菌,進(jìn)一步提升了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-賴氨酸能力和ε-PL生產(chǎn)效率。研究結(jié)果一方面說明了通過全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生產(chǎn)ε-PL是可行的,另一方面為S.albulus轉(zhuǎn)化大宗氨基酸L-賴氨酸生產(chǎn)高值ε-PL奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ),具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒如表1所示。其中S.albulusM-Z18由本實(shí)驗(yàn)室保藏,S.albulusGS114由M-Z18誘變而來[18]。大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α用作克隆宿主,E.coliET12567/pUZ8002在接合轉(zhuǎn)移中用作穿梭載體。整合型質(zhì)粒pIB139用于過表達(dá)菌株的構(gòu)建。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 引物

本研究所用引物及其序列如表2所示。

表2 本研究所用引物Table 2 Sequence of primers used in this study

1.3 試劑與儀器

ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit、2×Phanta?Max Master Mix,南京諾唯贊生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶、基因組提取試劑盒、片段純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒,大連TaKaRa公司;Trizol總RNA抽提試劑盒、卡那霉素(Kana)、安普霉素(Am)、氯霉素(Cm)、萘啶酮酸(Nal)、50×TAE緩沖液,上海生物工程股份有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

BIOTECH-5BG-7000APCR儀、Gel Doc EZ凝膠成像儀,Bio-Rad公司;DYCP-31DN電泳儀,北京市六一儀器廠;UV-2100微量分光光度計(jì),優(yōu)尼科儀器有限公司;AB204-N分析天平,瑞士梅特勒公司;GNP-9160恒溫培養(yǎng)箱,上海光都儀器設(shè)備有限公司;HYL-C組合式搖床,太倉市強(qiáng)樂設(shè)備有限公司;SBA-40C生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所。

1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10.0,胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,瓊脂粉20.0(固體培養(yǎng)基),pH 7.0。此培養(yǎng)基在37 ℃、200 r/min條件下用于大腸桿菌培養(yǎng)。

BTN瓊脂培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨2.0,酵母提取物1.0,瓊脂20,pH 7.5。此培養(yǎng)基用于鏈霉菌孢子的生成。

M3G培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 50.0,酵母提取物5.0,(NH4)2SO410.0,KH2PO41.36,K2HPO4·3H2O 0.8,MgSO4·7H2O 0.5,ZnSO4·7H2O 0.04,FeSO4·7H2O 0.03,pH 6.8。此培養(yǎng)基用于鏈霉菌種子培養(yǎng)與搖瓶發(fā)酵。

MS培養(yǎng)基(g/L):甘露醇20.0,黃豆粉20.0,瓊脂20.0。滅菌后加入MgCl2至終濃度10 mmol/L。

2×YT培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨16.0,酵母提取物10.0,NaCl 5.0,pH 7.0。

菌體生長培養(yǎng)基(g/L):甘油15.0,酵母粉5.0,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO40.13,Na2HPO4·12H2O 0.14,pH 6.8。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L)(未優(yōu)化):葡萄糖 60.0,檸檬酸10.0,(NH4)2SO410.0,L-賴氨酸8.0,pH 4.5。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L)(優(yōu)化后):葡萄糖80.0,檸檬酸20.0,(NH4)2SO46.0,L-賴氨酸15.0,pH 4.0。

以上所有培養(yǎng)基在需要時(shí)添加Km、Am、Cm和Nal,終質(zhì)量濃度分別為50.0、50.0、25.0、25.0 μg/mL。

1.5 發(fā)酵方法

種子培養(yǎng):挑取3環(huán)孢子接種至裝有80 mL M3G培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶,30 ℃、200 r/min,培養(yǎng)24 h。

搖瓶發(fā)酵:將種子液以體積分?jǐn)?shù)8%的接種量接入裝有40 mL M3G培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶,30 ℃、200 r/min,發(fā)酵72 h。

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化:參考兩階段培養(yǎng)法[8]并稍作改動(dòng)。將種子液以體積分?jǐn)?shù)8%的接種量接入裝有80 mL菌體生長培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶,30 ℃、200 r/min,培養(yǎng)12 h。5 000 r/min、4 ℃離心8 min收集菌體,棄上清液并用0.85%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl溶液等體積清洗菌體1次,相同條件收集菌體并重懸于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,隨后分裝10 mL混合液于25 mL錐形瓶,30 ℃、200 r/min,轉(zhuǎn)化96 h。

1.6 重組菌株的構(gòu)建

過表達(dá)菌株的構(gòu)建參考張重陽等[19]的方法。首先,以E.coliBL21全基因組為模板,通過引物lysp-F/R PCR擴(kuò)增得lysp。目標(biāo)片段純化后與線性化pIB139(NdeⅠ/EcoRⅠ)質(zhì)粒連接并轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α擴(kuò)增重組質(zhì)粒,提取質(zhì)粒完成雙酶切驗(yàn)證并測序。隨后,將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliET12567/pUZ8002,通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入S.albulusGS114得OE-lysp[20]。

1.7 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time-PCR,qRT-PCR)

參考張重陽等[19]的方法。對于每個(gè)樣本中的目的基因,將對照組(S.albulusGS114)中該基因的轉(zhuǎn)錄水平定義為1,結(jié)果顯示為相對于對照組中的變化倍數(shù)。相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)見表2。

1.8 檢測方法

發(fā)酵過程參數(shù)測定:ε-PL濃度測定采用甲基橙比色法[21],葡萄糖濃度和L-賴氨酸濃度使用生物傳感分析儀進(jìn)行測定[22],菌體干重測定參照刁文嬌等[20]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)方式對轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-聚賴氨酸的影響

S.albulusGS114在搖瓶發(fā)酵和轉(zhuǎn)化體系的過程參數(shù)如圖1所示。

a-搖瓶發(fā)酵體系(無L-賴氨酸)發(fā)酵過程參數(shù);b-搖瓶發(fā)酵體系(有L-賴氨酸)發(fā)酵過程參數(shù);c-兩階段轉(zhuǎn)化體系(未優(yōu)化)發(fā)酵過程參數(shù); d-搖瓶發(fā)酵體系與轉(zhuǎn)化體系發(fā)酵參數(shù)對比(FFS:搖瓶發(fā)酵體系;WCT:全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系)圖1 不同發(fā)酵體系對小白鏈霉菌轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-PL的影響Fig.1 Effect of different fermentation systems on the transformation of L-lysine to ε-PL synthesis by S.albulus

在搖瓶發(fā)酵體系中,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,培養(yǎng)基pH值在48 h下降至3.0,此后菌株基本不消耗葡萄糖,ε-PL合成也受到嚴(yán)重抑制,最終ε-PL產(chǎn)量為2.71 g/L(圖1-a)。在搖瓶發(fā)酵體系中添加L-賴氨酸時(shí),低pH也使得葡萄糖、L-賴氨酸利用受到限制(圖1-b)。而在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中,培養(yǎng)基pH值被有效控制在4.00～4.50,最終L-賴氨酸消耗量和ε-PL產(chǎn)量為5.50、10.74 g/L,相較于搖瓶發(fā)酵體系分別提升了4.0倍和2.9倍(圖1-c和圖1-d)。以上結(jié)果表明,搖瓶發(fā)酵體系pH不可控而產(chǎn)生的低pH環(huán)境(≤3.0)使得菌株利用L-賴氨酸的能力顯著降低,可能的原因是低pH環(huán)境終止了菌株的正常代謝。即便如此,在搖瓶發(fā)酵體系中添加的L-賴氨酸仍使得ε-PL產(chǎn)量提升了21.8%,這與LIU等[9]和LI等[10]的結(jié)果一致,證明了L-賴氨酸對ε-PL生產(chǎn)具有促進(jìn)作用。與此同時(shí),全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系解決了搖瓶發(fā)酵體系中pH不可控的問題,使得L-賴氨酸利用量和ε-PL產(chǎn)量均得到顯著提升,展現(xiàn)了其在轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-PL方面的光明前景。

2.2 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-聚賴氨酸體系優(yōu)化

2.2.1 葡萄糖濃度對轉(zhuǎn)化的影響

葡萄糖主要維持菌體的生存,同時(shí)也為ε-PL的合成提供部分前體,但過量的葡萄糖會(huì)產(chǎn)生抑制作用,因此需要確定合適的葡萄糖濃度。控制菌齡12 h,反應(yīng)溫度30 ℃,L-賴氨酸質(zhì)量濃度20 g/L,檸檬酸質(zhì)量濃度20 g/L,初始反應(yīng)pH 4.5,硫酸銨質(zhì)量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,在葡萄糖質(zhì)量濃度分別為60、70、80、90、100 g/L時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。結(jié)果如圖2-a所示,在葡萄糖質(zhì)量濃度<90 g/L時(shí),未表現(xiàn)出明顯的底物抑制作用,并在80、90 g/L時(shí)獲得了較高的ε-PL產(chǎn)量,分別為10.20、10.17 g/L。在100 g/L時(shí),底物抑制作用明顯,產(chǎn)量下降到8.57 g/L。因此,確定80 g/L的葡萄糖濃度為最佳轉(zhuǎn)化濃度。

2.2.2 菌齡對轉(zhuǎn)化的影響

不同菌齡的菌體通過控制ε-PL合成酶表達(dá)量影響ε-PL生產(chǎn)?？刂破咸烟琴|(zhì)量濃度80 g/L,反應(yīng)溫度30 ℃,L-賴氨酸質(zhì)量濃度20 g/L,檸檬酸質(zhì)量濃度20 g/L,初始反應(yīng)pH 4.5,硫酸銨質(zhì)量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,分別利用菌齡8 h(對數(shù)中期)、12 h(穩(wěn)定前期)、16 h(穩(wěn)定后期)的菌體進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成ε-PL,結(jié)果如圖2-b所示。隨著菌齡增加,ε-PL產(chǎn)量也逐步提升并在12、18 h獲得了較高的ε-PL產(chǎn)量,分別為10.22、10.59 g/L;考慮到18 h較12 h的菌體對ε-PL產(chǎn)量的提升僅為0.36 g/L,故選擇最優(yōu)轉(zhuǎn)化菌齡為12 h。

2.2.3 溫度對轉(zhuǎn)化的影響

溫度通過影響酶促反應(yīng)的效率而影響ε-PL的合成?？刂破咸烟琴|(zhì)量濃度80 g/L,菌齡12 h,L-賴氨酸質(zhì)量濃度20 g/L,檸檬酸質(zhì)量濃度20 g/L,初始反應(yīng)pH 4.5,硫酸銨質(zhì)量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,分別在25.0、27.0、30.0、32.0、35.0 ℃下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成ε-PL,結(jié)果如圖2-c所示。隨著溫度的上升,ε-PL產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,并在30 ℃時(shí)取得最高產(chǎn)量,達(dá)到10.90 g/L;在35 ℃時(shí)產(chǎn)量較低,僅為2.2 g/L。因此,確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化溫度為30 ℃。

2.2.4L-賴氨酸濃度對轉(zhuǎn)化的影響

L-賴氨酸是ε-PL的直接前體,對ε-PL的合成有著重要影響。控制葡萄糖質(zhì)量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應(yīng)溫度30 ℃,檸檬酸質(zhì)量濃度20 g/L,初始反應(yīng)pH 4.5,硫酸銨質(zhì)量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,在L-賴氨酸質(zhì)量濃度分別為6、9、12、15、18 g/L時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。結(jié)果如圖2-d所示,隨著L-賴氨酸質(zhì)量濃度的提升,ε-PL產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,并在質(zhì)量濃度15 g/L時(shí)獲得最高產(chǎn)量,達(dá)到13.00 g/L。因此,最佳L-賴氨酸質(zhì)量濃度為15 g/L。

2.2.5 檸檬酸濃度對轉(zhuǎn)化的影響

檸檬酸與檸檬酸鈉組成pH緩沖體系,若檸檬酸不足將導(dǎo)致緩沖體系失效,從而影響ε-PL的生產(chǎn)?？刂破咸烟琴|(zhì)量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應(yīng)溫度30 ℃,L-賴氨酸質(zhì)量濃度15 g/L,初始反應(yīng) pH 4.5,硫酸銨質(zhì)量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,在檸檬酸質(zhì)量濃度分別為 10、15、20、25、30 g/L 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。結(jié)果如圖2-e所示,低于20 g/L的檸檬酸濃度對ε-PL產(chǎn)量基本無影響,均取得了較高的產(chǎn)量,分別為13.00、13.10、13.20 g/L。當(dāng)質(zhì)量濃度大于20 g/L時(shí),ε-PL產(chǎn)量隨檸檬酸濃度的提升而下降,可能的原因是過量的檸檬酸對菌株產(chǎn)生了抑制作用。與此同時(shí),足量的檸檬酸有助于維持緩沖體系穩(wěn)定性。因此,最終確定最優(yōu)的檸檬酸質(zhì)量濃度為20 g/L。

2.2.6 pH對轉(zhuǎn)化的影響

pH值通過控制ε-PL降解酶和合成酶的活性而影響ε-PL生產(chǎn)?？刂破咸烟琴|(zhì)量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應(yīng)溫度30 ℃,L-賴氨酸質(zhì)量濃度15 g/L,檸檬酸質(zhì)量濃度15 g/L,硫酸銨質(zhì)量濃度10 g/L,濕菌體量1 600 g/L,在初始體系pH值分別為 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化合成ε-PL。pH對ε-PL生產(chǎn)的影響結(jié)果見圖2-f,當(dāng)pH值低于3.0時(shí),ε-PL無法合成;當(dāng)pH≥3.5時(shí),ε-PL產(chǎn)量隨pH的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,并在pH 4.0時(shí)產(chǎn)量最高,達(dá)到13.40 g/L。因此,最優(yōu)轉(zhuǎn)化pH值為4.0。

2.2.7 硫酸銨濃度對轉(zhuǎn)化的影響

硫酸銨是ε-PL從頭合成的氨基供體。控制葡萄糖質(zhì)量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應(yīng)溫度30 ℃,L-賴氨酸質(zhì)量濃度15 g/L,檸檬酸質(zhì)量濃度15 g/L,初始反應(yīng)pH 4.0,濕菌體量1 600 g/L,在硫酸銨質(zhì)量濃度分別為2、6、10、14、18 g/L時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。結(jié)果如圖2-g所示,隨著硫酸銨濃度的提升,ε-PL產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,并在6 g/L時(shí)ε-PL達(dá)到最高產(chǎn)量,為13.70 g/L。因此,最優(yōu)硫酸銨質(zhì)量濃度為6 g/L。

2.2.8 濕菌體量對轉(zhuǎn)化的影響

菌體量直接決定酶的含量。菌體量過小時(shí),酶量低,轉(zhuǎn)化效率低;菌體量過大,黏稠的發(fā)酵體系將降低營養(yǎng)物質(zhì)傳遞速率,從而降低轉(zhuǎn)化效率。因此,選擇合適的菌體量對轉(zhuǎn)化非常關(guān)鍵?？刂破咸烟琴|(zhì)量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應(yīng)溫度30 ℃,L-賴氨酸質(zhì)量濃度15 g/L,檸檬酸質(zhì)量濃度15 g/L,初始反應(yīng)pH 4.0,硫酸銨質(zhì)量濃度6 g/L,在濕菌體量分別為1 300、1 600、1 900、2 200、2 500 g/L時(shí)進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成ε-PL。結(jié)果如圖2-h,隨著菌體量的增大,ε-PL產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,并在1 900 g/L時(shí)獲得最大產(chǎn)量,達(dá)到13.8 g/L。確定最優(yōu)濕菌體量為1 900 g/L。

a-葡萄糖濃度;b-菌齡;c-溫度;d-L-賴氨酸濃度;e-葡萄糖濃度;f-pH;g-硫酸銨濃度;h-濕菌體量圖2 不同條件對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-PL的影響Fig.2 Effect of different conditions on whole-cell transformation of L-lysine to ε-PL synthesis

2.3 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-聚賴氨酸的過程分析

在最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系中考察了轉(zhuǎn)化過程參數(shù),結(jié)果如圖3-a所示。隨著轉(zhuǎn)化進(jìn)行,L-賴氨酸和葡萄糖被穩(wěn)定消耗直至轉(zhuǎn)化結(jié)束,ε-PL產(chǎn)量從12 h開始穩(wěn)定增長,96 h達(dá)到最高值13.80 g/L。轉(zhuǎn)化過程中,pH值維持在4.00～4.60,處于ε-PL合成的有效pH范圍。通過比較分析搖瓶發(fā)酵、優(yōu)化前、優(yōu)化后和優(yōu)化后(未添加L-賴氨酸)體系的發(fā)酵結(jié)果(圖3-b),發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后轉(zhuǎn)化體系獲得了最高的ε-PL產(chǎn)量、L-賴氨酸消耗質(zhì)量濃度和底物轉(zhuǎn)化率(葡萄糖+L-賴氨酸;消耗的L-賴氨酸等摩爾轉(zhuǎn)化為葡萄糖;下同)達(dá)到13.80、7.30 g/L和38.9%,分別是搖瓶發(fā)酵的4.1、6.6、3.2倍,較優(yōu)化前轉(zhuǎn)化體系分別提升了28.5%、32.7%和25.9%。值得注意的是,在優(yōu)化后(未添加L-賴氨酸)轉(zhuǎn)化體系中,ε-PL的產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率僅分別為5.20 g/L和18.4%,表明轉(zhuǎn)化體系中L-賴氨酸是影響ε-PL合成的關(guān)鍵。

2.4 重組小白鏈霉菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-聚賴氨酸

為了進(jìn)一步提升S.albulusGS114轉(zhuǎn)化能力,異源表達(dá)了來自E.coliBL21的L-賴氨酸特異性通透蛋白基因lysp,以進(jìn)一步提升菌株的L-賴氨酸攝入能力。重組質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖4-a所示,雙酶切驗(yàn)證條帶與目標(biāo)大小相符(圖4-b),表明異源表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒通過結(jié)合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入S.albulusGS114中,獲得重組菌OE-lysp。重組菌的qRT-PCR結(jié)果如圖4-c所示,lysp的相對表達(dá)水平是出發(fā)菌S.albulusGS114的152.4倍,表明目的基因成功異源表達(dá)。異源表達(dá)菌轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-PL結(jié)果如圖4-d所示,OE-lysp的ε-PL產(chǎn)量、L-賴氨酸消耗量和底物轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到17.21、9.20 g/L和45.8%,較出發(fā)菌分別提升了34.7%、26.0%和17.7%。以上結(jié)果表明,異源表達(dá)L-賴氨酸特異性通透蛋白能夠進(jìn)一步提升轉(zhuǎn)化能力。

a-全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系(優(yōu)化后)發(fā)酵過程參數(shù);b-不同發(fā)酵體系轉(zhuǎn)化 L-賴氨酸合成ε-PL結(jié)果[FFS:搖瓶發(fā)酵;CWT1:優(yōu)化前; CWT2:優(yōu)化后;CWT3:優(yōu)化后(無L-賴氨酸)]圖3 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-PL的過程分析Fig.3 Process analysis of whole-cell transformation to synthesize ε-PL from L-lysine

a-重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖;b-重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證結(jié)果;c-qRT-PCR;d-重組菌在轉(zhuǎn)化體系中的發(fā)酵結(jié)果參數(shù)圖4 重組小白鏈霉菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-賴氨酸合成ε-PLFig.4 Recombinant S.albulus for whole-cell transformation to synthesize ε-PL from L-lysine

3 結(jié)論

本文通過比較搖瓶發(fā)酵體系和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系合成ε-PL的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)了pH不可控是導(dǎo)致?lián)u瓶發(fā)酵利用外源L-賴氨酸效率低的重要原因;同時(shí),轉(zhuǎn)化體系表現(xiàn)出較強(qiáng)的L-賴氨酸轉(zhuǎn)化能力,ε-PL產(chǎn)量達(dá)到10.74 g/L,較搖瓶發(fā)酵提升了2.9倍。隨后,對轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基和條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化,獲得最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系:葡萄糖質(zhì)量濃度80 g/L,菌齡12 h,反應(yīng)溫度30 ℃,L-賴氨酸質(zhì)量濃度15 g/L,檸檬酸質(zhì)量濃度15 g/L,初始反應(yīng)pH 4.0,硫酸銨質(zhì)量濃度6 g/L,濕菌體量為1 900 g/L。在最優(yōu)體系中,ε-PL產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率分別為13.80 g/L和38.9%,較搖瓶發(fā)酵分別提高了4.1倍和3.2倍。最后,通過異源表達(dá)來自E.coliBL21的L-賴氨酸特異性通透蛋白基因lysp進(jìn)一步提升ε-PL產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別至17.21 g/L和45.8%,約為搖瓶發(fā)酵的6.4倍和3.3倍。本文研究結(jié)果,一方面說明了通過全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生產(chǎn)ε-PL是可行的,另一方面為S.albulus轉(zhuǎn)化大宗氨基酸L-賴氨酸生產(chǎn)高值ε-PL奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ),具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。