巖藻多糖酶產(chǎn)生菌的篩選及其酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征、抗氧化研究

楊柳,顧秋亞,王聰聰,李熙文,余曉斌

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

巖藻多糖也稱褐藻糖膠、巖藻聚糖硫酸酯、褐藻多糖硫酸脂等,是一類來自于褐藻的純天然、陰離子型[1]水溶性雜多糖,主要由含硫酸基的巖藻糖[2]組成,并伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、糖醛酸[3]等,這種獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予其抗腫瘤[4-5]、抗氧化[6]、降血脂[7]、抗炎[8]、抗凝血[9]、促益生菌[10]等生物活性。巖藻多糖作為一種性能優(yōu)良、功效獨特的海洋源[11]健康產(chǎn)品,其豐富的生理活性能夠有效提高人類健康水平,基于巖藻多糖在生命健康領(lǐng)域中的應(yīng)用價值,開展研究其功能和應(yīng)用具有重要的意義。

巖藻多糖作為一種大分子雜多糖,存在分子質(zhì)量大、溶解性差、不容易被吸收等問題,嚴重制約了其應(yīng)用。而以巖藻多糖為原料生產(chǎn)的低分子質(zhì)量巖藻多糖(low molecular weight fucoidan,LMWF)具有黏度低、溶解性好、易吸收等優(yōu)點,表現(xiàn)出較好的生物利用性。LMWF往往通過化學(xué)降解法[12]和生物降解法獲得,其中化學(xué)降解反應(yīng)條件劇烈、活性物質(zhì)易被破壞、產(chǎn)物分離純化難,限制了其應(yīng)用和發(fā)展。生物降解法主要指酶降解法,目前常用的酶為巖藻多糖酶[13],酶降解條件溫和、催化效率高、分子質(zhì)量易于控制,不會破壞多糖本身結(jié)構(gòu),可形成生物相容的活性產(chǎn)物,因此酶水解制備LMWF是當(dāng)前最理想的制備方法,擁有廣闊的應(yīng)用前景。

然而酶降解亦存在成本高、工業(yè)化生產(chǎn)難度大等缺點,故建立高效的產(chǎn)酶菌株篩選方法,篩選一株低成本、酶活性高的菌株是當(dāng)前的研究之重。目前常用于巖藻多糖酶產(chǎn)生菌篩選的檢測方法多為還原糖法、碳水化合物-聚丙烯酰胺凝膠電泳[14]以及對羥基苯甲酰肼法[15]。本研究首次利用高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC),從茶葉中篩選得到一株具有巖藻多糖酶活性的菌株,豐富了巖藻多糖酶產(chǎn)生菌的來源,為巖藻多糖酶產(chǎn)生菌的篩選提供了新思路。另外制備了低于10 kDa的LMWF,分析了其結(jié)構(gòu)特點,以及分子質(zhì)量大小與特定的生物活性之間的關(guān)系,為LMWF的研究和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

茶葉購自市場,菌株分離自茶葉。

1.1.2 試劑

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1115B超凈工作臺,上海智誠分析儀器制造有限公司;高壓滅菌鍋,美國致微儀器有限公司;SPX-250-Z恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進醫(yī)療器械廠;7GI-16M高速冷凍離心機、ICS-5000離子色譜儀,美國賽默飛世爾科技公司;1260高效液相色譜儀,美國安捷倫科技公司;NEXUS傅里葉變換紅外光譜儀,美國尼高力儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

改良PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200、茶葉25、蔗糖40、瓊脂20,pH自然。

篩選培養(yǎng)基(g/L):巖藻多糖10、NH4NO32、MgSO40.05、瓊脂20、青霉素0.05,pH自然。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL搖瓶):麩皮10 g、巖藻多糖0.3 g、UP水8 mL,pH 6.0。

上述培養(yǎng)基均在115 ℃滅菌30 min。

1.3.2 菌株篩選

取10 g黑毛茶溶于100 mL無菌水中,30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)4 h。取1 mL培養(yǎng)液進行10倍梯度稀釋,吸取200 μL稀釋液(10-1～10-7)涂布于篩選培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)3～6 d,挑取生長良好、形態(tài)不同的單菌落進行分離純化。所得菌株劃線于改良PDA平板,30 ℃培養(yǎng)4 d。使用內(nèi)含玻璃珠的無菌水將其制備成孢子數(shù)量為106個/mL的孢子懸液[16],吸取200 μL接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 d。發(fā)酵結(jié)束后向固態(tài)培養(yǎng)基中加入50 mL檸檬酸-檸檬酸鈉(0.1 mol /L、pH 6.0)緩沖液攪拌均勻,4 ℃浸提12 h,浸提后的酶液用紗布過濾,濾液離心(8 000 r/min、15 min)后獲得的上清液即為發(fā)酵粗酶液。

使用0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)將粗酶液稀釋至適當(dāng)濃度,分別取25 mL稀釋后粗酶液與25 mL 1%巖藻多糖溶液(0.1 mol /L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,pH 6.0)混合均勻,50 ℃反應(yīng)24 h后,沸水浴10 min終止反應(yīng)。冷卻后向其中添加1/4體積的Sevage[17][V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]溶液除蛋白,充分振搖30 min后去除有機相,重復(fù)操作多次至蛋白完全去除。減壓濃縮去除殘留有機溶液,使用500 Da透析袋低溫透析48 h除鹽,后減壓濃縮至5 mL;取1 mL樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,通過HPGPC測定其重均分子質(zhì)量(Mw)。在同一酶解條件下,酶解產(chǎn)物中LMWF相對含量越高證明其酶活力越大。

1.3.3 菌株鑒定

形態(tài)特征:將菌株接種于改良PDA培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)4 d,選取生長狀態(tài)良好的單菌落觀察形態(tài),并置于光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。

系統(tǒng)發(fā)育分析:將培養(yǎng)4 d的含菌平板送至上海生工生物工程有限公司測定其ITS全序列,測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對,比對結(jié)果利用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18],確定其生物學(xué)種屬。

1.3.4 LMWF制備

實驗前進行酶解工藝優(yōu)化[19],分別優(yōu)化了酶解反應(yīng)溫度(40、45、50、55、60 ℃);底物質(zhì)量濃度(5、10、15、20、25 g/L);反應(yīng)pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0);以及最適反應(yīng)時間(6、12、24、36、48 h)。在最佳酶解條件(50 ℃、1.5%、pH 6.0、36 h)下擴大反應(yīng)體系,反應(yīng)結(jié)束后煮沸滅活酶液,并進行除蛋白除鹽操作,后用10 kDa超濾管超濾分級,收集低于10 kDa的組分,減壓濃縮至適宜的體系,過0.22 μm的微孔濾膜除菌,冷凍干燥后存放于真空干燥皿待用。

1.3.5 巖藻多糖和LMWF初級結(jié)構(gòu)表征

1.3.5.1 硫酸基團(SO42-)含量測定

采用BaCl2-明膠比濁法[20]測定硫酸基團含量。分別稱取2種巖藻多糖樣品0.05 g于具塞試管中,加入5 mL HCl(1 mol/L),在121 ℃下水解5 h,取0.1 mL水解液待測。標準曲線:稱取烘干至恒重的K2SO4217.5 mg,以HCl(1 mol/L)溶解并定容至100 mL,搖勻得硫酸根標準液(1.2 mg/mL),硫酸根標準溶液用1 mol/L的HCl溶液稀釋至不同濃度,吸取50 μL于試管中,向其中加入200 μL BaCl2-明膠溶液、750 μL三氯乙酸溶液并混勻,室溫下靜置反應(yīng)25 min,測定360 nm下的吸光度。

1.3.5.2 單糖組成分析

參考俞所銀等[21]的方法,取5 mg樣品于指定容器中然后加入300 μL 2 mol/L的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),于100 ℃金屬浴反應(yīng)8 h;冷卻至室溫后用氮吹儀吹干,添加300 μL甲醇再次吹干,重復(fù)上述步驟多次,直至TFA完全除去。然后加入25 mL超純水溶解殘余物,稀釋10倍后過0.22 μm微孔濾膜除菌,使用離子色譜儀進行色譜分析。分析柱Carbo Pac PA20,流動相:A(超純水)、B(0.25 mol/L NaOH);流速0.5 mL/min;柱溫30 ℃;檢測器為脈沖安培檢測器;進樣體積20 μL。分別檢測樣品和1 mg/mL(巖藻糖、氨基半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)的單糖標準品。

1.3.5.3 分子質(zhì)量的測定

使用HPGPC測定樣品重均分子質(zhì)量,將待測多糖配成10 mg/mL的樣品,過0.22 μm微孔濾膜除菌。色譜柱為UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mm id×2),流動相為0.1 mol/L NaNO3,流速0.9 mL/min,柱溫45 ℃,檢測器為示差檢測器;進樣體積20 μL。標準曲線:將已知分子質(zhì)量的葡聚糖標準品(DextrantT系列)配為10 mg/mL的標準溶液,經(jīng)HPGPC檢測后,以保留時間為橫坐標、重均分子質(zhì)量的對數(shù)(lgMw)為縱坐標建立回歸方程。

1.3.5.4 傅里葉變換紅外光譜分析

將待測多糖烘干至恒重,取10 mg左右樣品于傅里葉變換紅外光譜儀[22]進行紅外掃描,采用全反射法,掃描區(qū)域為4 000～500 cm-1。

1.3.6 抗氧化活性測定

將待測多糖配制成適宜濃度的樣品溶液,按照測試試劑盒中的說明書分別測定巖藻多糖和LMWF的·OH、DPPH自由基清除能力,以及FRAP。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

結(jié)果報告為平均值±標準偏差(n=3),數(shù)據(jù)采用Origin 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻多糖酶產(chǎn)生菌的篩選與鑒定

2.1.1 菌株篩選

以巖藻多糖為唯一碳源,共從茶葉中篩選獲得真菌23株,經(jīng)過分離純化,選取7株生長較快、形態(tài)特征不一的菌株轉(zhuǎn)接至改良PDA培養(yǎng)基進行固態(tài)發(fā)酵,30 ℃培養(yǎng)4 d后,利用其粗酶液在50 ℃下酶解巖藻多糖24 h,使用HPGPC法對酶解產(chǎn)物進行檢測。結(jié)果如圖1所示,橫坐標為出峰時間,隨著出峰時間的延長分子質(zhì)量由大變小,因此大分子質(zhì)量的多糖先被檢測到;縱坐標為電壓響應(yīng)值,電壓響應(yīng)值大小與其樣品濃度呈正相關(guān),即樣品中同一聚合度的多糖濃度越高電壓響應(yīng)值越大。表1中面積百分占比為其相對含量占比。水解前巖藻多糖分子質(zhì)量為277 kDa,無LMWF存在。如圖1所示,菌株JH-5酶解產(chǎn)物出峰時間最晚,說明其中LMWF占比較多,相對含量為59.4%(表1),除了菌株JH-1酶解產(chǎn)物中未檢測到LMWF,余下菌株酶解產(chǎn)物中LMWF相對含量均在10%左右,說明其中只有少數(shù)巖藻多糖被水解,菌株發(fā)酵粗酶液酶活力較低。此外,分散系數(shù)(Mw/Mn)用來衡量多聚物分子質(zhì)量分布的分散程度,當(dāng)分散系數(shù)為1時,表明聚合物是由均一分子質(zhì)量的聚合物組成的,分散系數(shù)越大,表明聚合物的分子質(zhì)量分布范圍越寬。菌株JH-5來源的巖藻多糖酶水解產(chǎn)物分散系數(shù)為2.15,表明聚合物L(fēng)MWF鏈長差距較大,分子質(zhì)量分布范圍相對較寬。在相同的酶解條件下,菌株JH-5來源的巖藻多糖酶的酶解產(chǎn)物中LMWF相對含量最高,因此確定菌株JH-5為出發(fā)菌株進行后續(xù)研究。

圖1 菌株發(fā)酵粗酶液酶解巖藻多糖的HPGPC分析Fig.1 HPGPC analysis of fucoidan hydrolyzed by crude enzyme solution fermented by strain

表1 產(chǎn)物中LMWF的分子質(zhì)量及占比Table 1 Molecular weight and proportion of LMWF in products

2.1.2 菌株鑒定

如圖2-a所示,菌株JH-5于改良PDA固體培養(yǎng)基上生長4 d后,觀察到其菌落呈現(xiàn)為橢圓形,表面粉末狀,顏色有數(shù)環(huán);菌落隨生長時間的增加,從內(nèi)向外依次呈綠色、黃色,邊緣為新生菌落,呈白色絲絨狀,產(chǎn)孢囊孢子。通過光學(xué)顯微鏡可以觀察到多個傘狀孢囊孢子(圖2-b);通過掃描電子顯微鏡(圖2-c)可以觀察到,菌株JH-5的分生孢子頂部膨大成孢囊,分生孢子呈輻射狀孢子鏈,孢子鏈有隔。根據(jù)其形態(tài)特征,初步鑒定為曲霉屬(Aspergillussp.)。

a-菌落形態(tài);b-光學(xué)顯微鏡下孢囊孢子形態(tài); c-電子顯微鏡下孢囊孢子形態(tài)圖2 JH-5的菌落及顯微鏡下的孢子形態(tài)Fig.2 Colony and microscopic spore morphology of JH-5

系統(tǒng)發(fā)育分析:將培養(yǎng)4 d的含菌平板送至上海生工生物工程有限公司進行ITS測序,測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對,將對比結(jié)果通過MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。綜合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果,菌株JH-5被鑒定為Aspergillusamstelodami。

圖3 菌株JH-5的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain JH-5

2.2 巖藻多糖和LMWF的初級結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 硫酸基團含量測定

巖藻多糖主要是由含有硫酸基的巖藻糖構(gòu)成的水溶性多糖,其分子結(jié)構(gòu)的主要成分是L-巖藻糖和硫酸基,ZAYED等[23]研究發(fā)現(xiàn)硫酸基結(jié)構(gòu)和含量與其活性密切相關(guān),因此有必要檢測產(chǎn)物的硫酸基變化。水解前巖藻多糖硫酸基團含量為(33.0±0.3)%,水解后的LMWF硫酸基團含量為(32.4±0.9)%,表明在水解過程中硫酸基損失較小,來源于菌株JH-5的巖藻多糖酶可以溫和地降解巖藻多糖,水解后的產(chǎn)物L(fēng)MWF不會因為硫酸基變化而影響其生物活性。

2.2.2 單糖組成分析

利用離子色譜測定F、LMWF的單糖組成。結(jié)果如表2所示,F主要由巖藻糖和半乳糖組成,此外還含有少量的木糖和葡萄糖醛酸,表明巖藻多糖是由多種單糖組成的非均一性雜多糖[24],其單糖組成符合裙帶菜來源的巖藻多糖成分特征[25]。對酶解產(chǎn)物L(fēng)MWF的單糖組成進行檢測,其中的巖藻糖的摩爾百分含量相較于F略有下降,半乳糖和葡萄糖醛酸的摩爾百分含量略有升高,木糖的摩爾百分含量無明顯變化,表明水解產(chǎn)物的單糖組成和含量相對穩(wěn)定,不會因為組分的變化而過多的影響其生物活性。

表2 F和LMWF的單糖摩爾百分比Table 2 Molar percentage of monosaccharide in F and LMWF

2.2.3 分子質(zhì)量的測定

使用HPGPC法測定F、LMWF的分子質(zhì)量。結(jié)果如圖4所示,F的分子質(zhì)量為277 kDa,LMWF的分子質(zhì)量為2 997 Da,分散系數(shù)為2.7(表3),表明該聚合物中LMWF鏈長差距大,分子質(zhì)量分布范圍相對較寬,表明酶解產(chǎn)物L(fēng)MWF是非均一性的多糖。

圖4 F和LMWF的HPGPC分析Fig.4 HPGPC analysis of F and LMWF

表3 F和LMWF的分子質(zhì)量Table 3 Molecular weight of F and LMWF

2.2.4 傅里葉變換紅外光譜分析

如圖5所示,F在3 391 cm-1處的吸收峰是—OH的伸縮振動,在2 934 cm-1附近有小吸收峰,是由C—H 的伸縮振動引起的,1 633 cm-1處的吸收峰表明存在羧基的C—O鍵振動,1 376 cm-1吸收峰屬于δ-CH2的彎曲振動,1 217 cm-1處的吸收峰是C—O—C的伸縮振動引起的,1 017 cm-1處的峰表明存在吡喃糖環(huán),826 cm-1處是α-糖苷鍵的吸收峰。LMWF在3 405 cm-1的寬吸收峰是—OH的伸縮振動引起的,2 935 cm-1處的吸收峰是由于C—H的伸縮振動,1 637 cm-1的吸收峰由于羧基的C—O鍵存在引起的,1 372 cm-1處的吸收峰屬于δ-CH2的彎曲振動,1 225 cm-1和1 148 cm-1處的吸收峰歸因于C—O—C的伸縮振動,1 019 cm-1屬于吡喃糖環(huán)的吸收峰,824 cm-1處是α-糖苷鍵的吸收峰。2種多糖在890 cm-1處均沒有特征吸收峰,說明不存在β-糖苷鍵,2種多糖均以α-糖苷鍵為主,符合巖藻多糖糖苷鍵的結(jié)構(gòu)類型。圖中顯示樣品在1 550 cm-1附近沒有吸收峰,不存在酰胺鍵(—CO—NH—C—),表示樣品中的蛋白質(zhì)去除比較徹底。

圖5 F和LMWF的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.5 FTIR patterns of F and LMWF

2.3 抗氧化活性測定

如圖6所示,各樣品隨著濃度上升其抗氧化能力呈現(xiàn)不斷上升的趨勢,并表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。當(dāng)樣品濃度較低時,F和LMWF清除活性差異較小;隨著濃度的增加,LMWF抗氧化活性快速增長,與F的差距逐漸加大,優(yōu)勢變得明顯。LMWF具有明顯優(yōu)于未水解巖藻多糖的抗氧化活性,表明抗氧化活性受巖藻多糖分子質(zhì)量影響較大,其分子質(zhì)量與生物活性功能之間存在著一定的關(guān)系。

a-·OH清除能力;b-DPPH自由基清除能力;c-FRAP圖6 F和LMWF的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of F and LMWF

3 結(jié)果與討論

利用HPGPC檢測酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量的變化,建立了一種新的巖藻多糖酶產(chǎn)生菌篩選的檢測方法,為后續(xù)巖藻多糖酶產(chǎn)生菌的篩選提供了新的方向。對發(fā)酵粗酶液酶解制備的LMWF結(jié)構(gòu)解析表明,該酶可以溫和穩(wěn)定地水解巖藻多糖,不會破壞產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以及有效活性成分。對水解前后巖藻多糖的抗氧化研究結(jié)果顯示,LMWF對于清除·OH、DPPH自由基,以及FRAP明顯高于巖藻多糖,并隨著濃度的增加差異逐漸增大,表明其抗氧化活性受分子質(zhì)量影響巨大,突出了LMWF的應(yīng)用潛力,未來可用于具有抗氧化功能的保健品以及食品加工生產(chǎn)中的功能性成分。后續(xù)對巖藻多糖的研究,應(yīng)繼續(xù)探究其結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系,闡明其作用機制,為巖藻多糖的開發(fā)和利用提供更多的理論依據(jù)。