產(chǎn)甘油假絲酵母25S rRNA甲基轉移酶BMT5對乙酸脅迫耐受的影響及應用

周柳,陸信曜,宗紅,諸葛斌*

1(江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院,工業(yè)微生物及 多元醇研究設計中心,江蘇 無錫,214122)

木質纖維素乙醇的開發(fā)利用是解決能源危機的有效途徑[1]。木質纖維素預處理過程會釋放大量抑制微生物菌體生長和發(fā)酵的抑制劑,如乙酸、糠醛、5-甲基糠醛和酚類物質等[2]。提高微生物菌株對發(fā)酵抑制劑的耐受性有利于纖維素乙醇生產(chǎn)技術的發(fā)展[3]。

產(chǎn)甘油假絲酵母(Candidaglycerinogenes)WL2002-5是一株有自主知識產(chǎn)權與多重抗逆性能的工業(yè)安全菌株[4],具有生長與發(fā)酵速率快、耐高溫和耐高滲透壓等特性[5],在生物合成化合物方面有重要應用[6-7]。但是通過轉錄組數(shù)據(jù)不能獲得其大量的功能基因。因此前期實驗構建了C.glycerinogenes基因組文庫,通過文庫的篩選[8],獲得能夠提高酵母菌株乙酸耐受性的基因CgBmt5。CgBmt5編碼25S rRNA甲基轉移酶,負責25S rRNA甲基化,預測參與核糖體的生物發(fā)生[9]。

本研究以C.glycerinogenes的CgBmt5為研究對象,通過在S.cerevisiae中過表達CgBmt5初步確定CgBmt5的乙酸脅迫耐受性;其次在C.glycerinogenes中過表達CgBmt5,考察過表達菌株在乙酸及未脫毒纖維素水解液中的乙醇發(fā)酵性能,為工業(yè)菌株的利用和纖維素乙醇技術發(fā)展提供新的生物材料。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

本研究所使用的菌株和質粒如表1所示,設計的引物如表2所示。

表2 本實驗設計引物Table 2 Primers used in this study

1.2 試劑與儀器

酵母粉和蛋白胨,OXOID公司;酵母無氨基氮源(yeast nitrogen base, YNB)與酵母基因組DNA快速抽提試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、限制性內切酶和pMD19-T Vector Cloning Kit, TaKaRa公司;AB clonal MultF Seamless Assembly Mix,武漢愛博泰克生物科技有限公司;AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;質粒提取試劑盒、柱回收試劑盒和凝膠回收試劑盒,上海捷瑞生物工程有限公司;所用引物由無錫天霖技術有限公司合成;過氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒,索萊寶公司。

PCR擴增儀和實時熒光定量基因擴增儀、AminexHPX-87H柱,Bio-Rad公司;高效液相色譜儀,江蘇漢邦科技有限公司;RI-101折射率檢測器,Shodex;紫外分光光度計,北京普析通用公司。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10.0,蛋白胨10.0,酵母提取物5.0;抗性平板需添加100 μg/mL的氨芐青霉素。

MM培養(yǎng)基(g/L):YNB 6.7,葡萄糖20.0,pH值為7.0。

YPD培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20.0,酵母提取物10.0,葡萄糖20.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20.0,酵母提取物10.0,葡萄糖160.0,乙酸85 mmol/L或120 mmol/L,30 ℃,100 r/min。

固體培養(yǎng)基需要添加20 g/L的瓊脂粉。

1.3 統(tǒng)計學分析 建立Epidate數(shù)據(jù)庫，通過SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學檢驗。計量資料采用采用均數(shù)±標準差(±s)描述、組間資料采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理。患者與照顧者之間相關性分析用Person相關性分析。

培養(yǎng)方法:E.coliJM109在含有100 μg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng),用以本研究中所有質粒構建;S.cerevisiaeCEN PK2-1C用于所有重組質粒的轉化,并于30 ℃條件下利用YPD培養(yǎng)基進行培養(yǎng);C.glycerinogenes/ΔURA5用于所有過表達菌株的轉化,并于30 ℃條件下利用MM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 重組菌生長耐受驗證

點板驗證:取1%～2%重組菌株一級種子液于10 mL YPD培養(yǎng)基中于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12～14 h后,6 000 r/min離心2 min收集菌體,并用生理鹽水洗滌細胞2～3次,調整到相同的初始OD600值(1.0),10倍比依次稀釋,點種于含85 mmol/L乙酸的YPD平板上,30 ℃培養(yǎng)3 d。

搖瓶驗證:重組S.cerevisiae菌株在YPD培養(yǎng)基中轉接2次,待菌株生長至對數(shù)生長期時,調整初始OD600值為0.1,接種至裝有100 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,并在脅迫條件下培養(yǎng),每6 h取樣用于脅迫生長分析,生物量以OD600表示。

1.5 CgBmt5在C.glycerinobgenes中過表達

在C.glycerinogenes中過表達CgBmt5。使用同源重組的方法構建過表達載體,將構建好的過表達載體采用PEG/LiAc法轉化C.glycerinogenes/ΔURA5感受態(tài)細胞。獲得的過表達菌株在YPD培養(yǎng)基中轉接2次,待菌株生長至對數(shù)生長期時,調整初始OD600值為0.1,接種至裝有50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,并在脅迫條件下培養(yǎng),每6 h取樣用于脅迫生長分析,生物量以OD600表示。

1.6 RNA提取和實時熒光定量PCR

將C.glycerinogenes過表達菌株在YPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)期,以1%接種量轉接至裝有50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,待培養(yǎng)至對數(shù)期,加入120 mmol/L乙酸培養(yǎng)2 h,6 000 r/min離心5 min收集細胞,并在液氮中儲存。樣品的總RNA提取等依據(jù)產(chǎn)品說明書進行,根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的檢測結果評估總RNA質量。用于轉錄水平測定,每種樣品設置4個重復。

1.7 脂質過氧化水平測定

對數(shù)生長期酵母細胞脅迫處理4 h,6 000 r/min,5 min收集菌體,無菌水洗2次后,加入1 mL 2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid,TBA)試劑(0.25 mol/L HCl,質量分數(shù)15%三氯乙酸,和質量分數(shù)0.375% TBA),100 ℃煮沸15 min后12 000 r/min,4 ℃離心20 min取上清液,用紫外分光光度計測定其在532 nm處的吸光值,TBA試劑為空白對照。脂質過氧化水平通過每克菌體蛋白所占硫代巴比妥酸值即硫代巴比妥酸反應物(2-thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)表示。

1.8 CAT和SOD活性測定

將C.glycerinogenes過表達菌株在YPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)期,以1%接種量轉接至裝有50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,待培養(yǎng)至對數(shù)期,加入120 mmol/L乙酸脅迫處理4 h,6 000 r/min,5 min收集菌體后按照試劑盒方法檢測CAT和SOD活性。

1.9 過表達菌株在未脫毒纖維素水解液中乙醇發(fā)酵

1.10 葡萄糖、甘油和乙醇含量測定

生物量以OD600表示。葡萄糖、乙醇和甘油含量通過HPLC測量,發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min,取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,使用AminexHPX-87H柱和RI-101折射率檢測器,溫度60 ℃。流動相為5 mmol/L H2SO4溶液,流速為0.6 mL/min。

2 結果與分析

2.1 CgBmt5對釀酒酵母乙酸耐受和發(fā)酵性能的影響

經(jīng)基因組文庫篩選、測序比對,獲得促進菌株耐受乙酸的基因CgBmt5。與對照菌(S.cerevisiae/p414-kan)相比,重組菌S.cerevisiae/p414-kan-CgBmt5在85 mmol/L乙酸下生長更優(yōu)(圖1-a),滯后期縮短約12 h,乙醇產(chǎn)量60.5 g/L,提高17.7%;單位菌體乙醇產(chǎn)量12.9 g/L,提高27.7%;轉化率41.6%,提高17.8%,生產(chǎn)強度提高17.6%,生物量無明顯變化(圖1-b)。上述結果表明,CgBmt5可以提高乙酸脅迫下釀酒酵母的生長及乙醇發(fā)酵性能。

2.2 過表達CgBmt5對C.glycerinogenes脅迫耐受的影響

120 mmol/L乙酸脅迫下,在C.glycerinogenes中過表達CgBmt5,過表達菌株滯后期縮短24 h,乙醇產(chǎn)量62.7 g/L,提高17.6%,單位菌體乙醇產(chǎn)量12.3 g/L,提高17.1%;轉化率46.1%,提高17.6%;生產(chǎn)強度提高47.7%,終生物量無明顯差異(圖2-a)。 結果表明,在C.glycerinogenes中過表達CgBmt5可提高120 mmol/L乙酸脅迫下的乙醇發(fā)酵性能。

a-85 mmol/L乙酸脅迫下點板結果; b-85 mmol/L乙酸脅迫下乙醇發(fā)酵性能圖1 CgBmt5對S.cerevisiae乙酸耐受及發(fā)酵性能的影響Fig.1 Effects of CgBmt5 on acetic acid tolerance and fermentation performance of S. cerevisiae

a-C.glycerinogenes乙醇發(fā)酵;b-乙醇發(fā)酵副產(chǎn)物甘油產(chǎn)量圖2 過表達CgBmt5對C.glycerinogenes乙醇 發(fā)酵性能的影響Fig.2 Effect of overexpression of CgBmt5 on the ethanol fermentation performance of C.glycerinogenes

如圖2-b所示,甘油是乙醇發(fā)酵的副產(chǎn)物,產(chǎn)量5.1 g/L,單位菌體甘油產(chǎn)量1.0 g/L,與對照無明顯差異,生產(chǎn)強度提高了20.5%。 結果表明,乙酸脅迫下,過表達CgBmt5不能提高菌株甘油積累量。

為了探索過表達菌株的耐酸機制,進一步分析了過表達菌株的細胞膜脂質過氧化水平以及CAT和SOD的活性(圖3)。在正常條件下,對照菌和過表達菌株的脂質過氧化水平相似。而在乙酸脅迫下,過表達菌株脂質過氧化水平降低18.1%(圖3-a),表明CgBmt5可能通過降低過表達菌株的膜脂質過氧化水平調控細胞應對乙酸脅迫;過表達菌株CAT和SOD活性分別為9.2 U/mg蛋白、34.7 U/mg蛋白(圖3-b),增加73.6%和53.5%,表明過表達CgBmt5后菌株乙酸耐受性的變化與抗氧化酶活性增高有關。

a-C.glycerinogenes脂質過氧化水平; b-C.glycerinogenes過氧化物酶活性圖3 過表達CgBmt5對C.glycerinogenes脂質 過氧化水平及過氧化物酶活力的影響Fig.3 Effect of overexpression of CgBmt5 on lipid peroxidation level and peroxidase activity of C.glycerinogenes注:脅迫條件均為120 mmol/L乙酸。

為研究CgBmt5對菌株胞內代謝的調控機制,檢測了乙酸耐受相關基因甘油-3-磷酸脫氫酶基因(Gpd1)、鳥氨酸氨基甲酰轉移酶基因(Arg3)、質膜P2型H+-ATP酶基因(Pma1)、磷酸果糖激酶基因1(Pfk1)和細胞色素c氧化酶亞基Ⅲ基因(Cox3)的相關轉錄水平。乙酸脅迫下,這些基因部分上調(圖4),其中Arg3的轉錄水平提高了4.8倍,糖酵解途徑關鍵酶基因Pfk1上調1.5倍。以上結果表明,過表達CgBmt5能夠影響上述酸脅迫響應基因的轉錄。

圖4 乙酸耐受相關基因轉錄水平Fig.4 Transcription levels of genes related to acetic acid tolerance注:Gpd1為甘油合成途徑關鍵限速酶,甘油的生物合成有助于細胞的氧化還原平衡,和氧化、高滲脅迫有關;Pma1將質子泵出細胞,是細胞質pH和質膜電位的主要調節(jié)因子;Pfk1是糖酵解途徑關鍵酶,其活性與糖代謝相關;Arg3是精氨酸合成關鍵酶,精氨酸可以通過精氨酸脫亞胺酶途徑產(chǎn)生NH3用于中和胞內質子,同時產(chǎn)生的ATP 通過ATPase將胞內質子泵出胞外;Cox3是細胞色素氧化酶,乙酸脅 迫會影響電子傳遞鏈。

2.3 過表達菌株利用纖維素水解液發(fā)酵乙醇

將CgBmt5過表達菌株C.glycerinogenesΔURA5/pURGAP-CgBmt5應用于纖維素水解液發(fā)酵乙醇,過表達菌株長勢優(yōu)于對照,生物量提高了67.6%;乙醇產(chǎn)量21.8 g/L,提高71.7%;單位菌體乙醇產(chǎn)量2.9 g/L,提高26.1%;轉化率36.3%,提高65.0%,生產(chǎn)強度提高155.7%。綜上所述,在C.glycerinogenes菌株中過表達CgBmt5可以顯著提高菌株對多重脅迫、復雜環(huán)境的耐受性,從而提高纖維素水解液的乙醇發(fā)酵性能。

圖5 CgBmt5過表達菌株利用纖維素水解液發(fā)酵乙醇Fig.5 CgBmt5 overexpressed strain ferments ethanol with fiber hydrolysateh

3 結論與討論

rRNA存在糖和堿基部分甲基化或尿苷異構化為假尿苷2種類型的修飾,參與翻譯起始、易位、終止及mRNA的結合等,從而影響翻譯和基因調控[10-12]。動物細胞中,敲除28S rRNA甲基轉移酶NML減少了60S亞基數(shù)量,增加RPL11-MDM2相互作用并誘導p53激活,使細胞凋亡、細胞周期停滯和蛋白質合成受抑制,從而影響細胞增殖[13]。敲除16S rRNA甲基轉移酶YebU使得大腸桿菌生長變慢、環(huán)境適應性降低[14]。Bmt2和Bmt3與Bmt5具相同結構域,其缺陷株對茴香霉素和過氧化物敏感,表明rRNA拓撲結構變化[15-16]。敲除Bmt4導致pre-rRNA加工缺陷,顯著影響60S核糖體的發(fā)生[17]。因此,Bmt家族可以改變rRNA的加工和結構等影響細胞表型。Bmt5是25S rRNA的甲基轉移酶,但缺失Bmt5的釀酒酵母在不同溫度下未見生長缺陷和抗生素敏感,也不影響核糖體的化學計量和翻譯[9],表明不同rRNA甲基轉移酶對核糖體功能和細胞表型的影響存在差異。本研究中,過表達CgBmt5對S.cerevisiae和C.glycerinogenes的乙酸耐受和發(fā)酵表型均有促進作用,進一步說明不同來源rRNA甲基轉移酶功能上存在差異。

乙酸脅迫會使胞內發(fā)生氧化應激而損害細胞組分,如蛋白質、脂質和DNA等,細胞膜脂質過氧化是細胞發(fā)生氧化應激的直接體現(xiàn)之一[18]。本研究發(fā)現(xiàn),乙酸脅迫下過表達CgBmt5菌株的脂質過氧化水平降低,表明CgBmt5對應對胞內氧化應激脅迫具有優(yōu)勢。同時,過表達菌株SOD和CAT活性明顯增加,SOD在氧自由基解毒中起重要作用,所產(chǎn)生的過氧化氫由CAT分解,從而保護酵母細胞免受氧化損傷[19],這與過表達菌株細胞膜脂質過氧化水平降低相印證,因此過表達CgBmt5后菌株乙酸耐受性的改善與脂質過氧化水平的降低及SOD和CAT活性增加有關。

釀酒酵母中,敲除Bmt1后3-磷酸甘油酸激酶等9個糖代謝關鍵酶下調[20-21]。而CgBmt5的過表達上調了磷酸果糖激酶Pfk1,使得脅迫下單位菌體耗糖能力增加。Gpd1下調,但甘油積累和單位菌體甘油產(chǎn)量卻無明顯差異,表明甘油作為乙醇的副產(chǎn)物,上游碳供給是其積累的限制性因素,酶活力對其合成影響不大。質膜ATP酶Pma1轉錄水平未見明顯變化,表明Bmt5可能對其無明顯調控。乙酸脅迫會下調參與呼吸的細胞色素c氧化還原酶(Cor1,Cox11等)[22]。過表達CgBmt5,Cox3進一步下調,表明GgBmt5可能進一步抑制了電子傳遞鏈。精氨酸可以通過精氨酸脫亞胺酶途徑(ADI)產(chǎn)生NH3用于中和胞內質子,同時產(chǎn)生的ATP通過ATPase將胞內質子泵出胞外[23-24]。鳥氨酸氨基甲酰轉移酶Arg3是精氨酸合成關鍵酶,Arg3上調有助于胞內精氨酸積累,增強菌株對乙酸的耐受性[25]。

綜上,本研究證實CgBmt5通過影響過氧化物酶SOD和CAT的活性,緩解ROS對細胞造成的損傷以及影響C.glycerinogenesΔURA5酸脅迫響應基因Pfk1、Gpd1、Cox3、Arg3的轉錄,通過促進胞內精氨酸合成途徑、上調磷酸果糖激酶Pfk1等方式提高菌株對乙酸的耐受性及乙酸脅迫下的乙醇發(fā)酵性能,增強纖維素水解液乙醇的單位菌體產(chǎn)量和底物轉化率,為酵母脅迫耐受的研究和纖維素乙醇技術發(fā)展提供新的生物材料。