氧化鈰納米顆粒種子引發對鹽脅迫下辣椒種子萌發及幼苗生長的影響

秦中維, 林欣琪, 魏茜雅, 梁臘梅, 李映志

(廣東海洋大學 濱海農業學院, 廣東 湛江 524088 )

土壤鹽漬化是阻礙農作物生產力提高的主要非生物脅迫因素之一,可影響種子的順利萌發和幼苗的健康生長(Yan et al., 2022)。鹽脅迫易使細胞中有毒離子(Na+和Cl-)過量積累,抑制水分吸收(Yang et al., 2020),同時會導致大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生,如過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)和超氧陰離子(superoxide anion, O2-)(Yin et al.,2021),使細胞膜遭受氧化毒害,導致氧化應激反應,不僅影響辣椒(Capsicumannuum)、駝蹄瓣屬(Zygophyllum)、蔓菁(Brassicarapa)等植物種子的萌發 (Gammoudi et al.,2022; Hussain et al., 2022; Zhou et al., 2022),還影響辣椒、牛角瓜(Calotropisgigantea)、小麥(Triticumaestivum)等幼苗的正常生長(Ke et al., 2018; 肖中林,2022;Nouman & Aziz, 2022),甚至降低稻(Oryzasativa)等作物的產量(沙漢景等,2017)。因此,探究如何提高種子在鹽脅迫下的發芽率和增強植株的鹽脅迫耐受能力,對解決我國土壤鹽漬化問題、保障作物的安全及社會穩定發展具有重大意義(Raffaella et al., 2022)。

種子引發是一種新興的應對鹽漬化脅迫的種子處理技術,即在種子發芽前用天然和/或合成引發劑處理,誘導種子進入特定的生理狀態,可通過記憶效應使植物通過改變關鍵信號分子、轉錄因子等來抵御生長期發生的鹽脅迫(Shang et al., 2019; Goyal et al., 2021)。多種納米材料如氧化鋅納米顆粒(zinic oxide nanoparticles, ZnONPS)、硒納米顆粒(selenium nanoparticles, SeNPs)、氧化鈰納米顆粒(cerium oxide nanoparticles, CeO2NPS)等被用于種子引發(Rawashdeh et al., 2020;Prakash et al., 2021; Sardar et al., 2022)。其中,CeO2NPS是一種新興納米材料,因具有超強自由基清除能力被廣泛運用于醫療、化妝品行業,近年來也被運用于納米農業中(Newkirk et al., 2018)。CeO2NPS通過Ce3+和Ce4+懸空鍵模擬抗氧化酶活性減少ROS的過度積累,從而緩解植物的氧化應激反應,提高植物對逆境的耐受性。Khan等(2021)研究發現,CeO2NPS通過種子引發處理后可提高蕓薹(Brassicarapa)種子的α-淀粉酶活性和清除過量ROS,并提高其在鹽脅迫下的發芽率,同時可在苗期通過提高鹽脅迫下蕓薹幼苗的SOD、POD活性和可溶性糖含量,進而增強蕓薹的耐鹽性,最終促進蕓薹生物量的提高。目前,有關CeO2NPS通過種子引發處理對辣椒鹽脅迫下生長發育影響方面的研究還罕有報道。辣椒,為茄科辣椒屬植物,由于其具有促進食欲、改善消化、抗菌殺蟲等作用,深得廣大群眾的喜愛(鄒學校等,2022)。目前,我國已成為鮮辣椒產量最高的國家,種植面積為78萬公頃,產量為1 900萬噸(王立浩等,2019);其果實含有大量的生物活性化合物(如辣椒素),在食品、醫藥、化妝品行業中有廣泛的應用前景(張天舉等,2019)。

為探究辣椒耐鹽堿栽培技術措施及其耐鹽機制,本研究以茂蔬360為試驗材料, 通過種子引發處理和生理生化分析,旨在探明:(1)CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒種子萌發、幼苗生長的影響;(2)CeO2NPS種子引發處理提高辣椒耐鹽性的最佳濃度;(3)種子引發處理提高辣椒耐鹽性的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗于2022年3月至8月在廣東海洋大學濱海農業學院進行。供試材料為辣椒,品種為茂蔬360。

1.2 試驗設計

1.2.1 種子引發處理 參考Newkirk等(2018)的方法合成氧化鈰納米顆粒(CeO2NPS)溶液,并將新合成的CeO2NPS溶液保存在4 ℃,分別配置成濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1(分別用S0、S0.05、S0.1、S0.2、S0.3、S0.4、S0.5表示)的CeO2NPS溶液,其中,0 mmol· L-1CeO2NPS溶液(S0)為滲透緩沖液,由100 mmol·L-1TES和100 mmol·L-1MgCl2組成,用HCl調節pH為7.5,作為CeO2NPS溶液的陰性對照。挑選粒大飽滿、大小均一的辣椒種子約2 g置于燒杯中,分別加入10 mL不同濃度的CeO2NPS溶液,封口后置于培養箱中引發24 h。用蒸餾水將種子沖洗干凈,濾紙吸干后回干至初始含水量。

1.2.2 種子發芽 將未引發處理(CK)和引發處理的辣椒種子置于標準發芽皿(10 cm × 10 cm × 5 cm)中,加入5mL的100 mmol·L-1的NaCl溶液模擬鹽脅迫,放置在25 ℃的光照培養箱中進行發芽試驗,每個處理60粒種子,重復3次。

1.2.3 幼苗生長 將CK和不同濃度CeO2NPS引發處理后的辣椒種子分別播種于混有蛭石椰糠的育苗盤中,每盤播50(5×10)粒發芽種子,并澆入濃度為100 mmol·L-1的NaCl溶液模擬鹽脅迫。于室溫下培養至幼苗兩葉一心取樣,進行各項指標的測定。

1.3 指標測定

1.3.1 種子萌發指標 以胚根突破種皮2 mm作為種子萌發過程中的發芽標準。保持每天記錄辣椒種子的發芽數,直到無種子發芽為止。參考Gammoudi等(2020)的方法計算發芽勢(germination potential,GP)、發芽率(germination rate,GR)、發芽指數(germination index,GI)、活力指數(vigor index,VI)。

發芽勢(GP)=(3 d內發芽數/供試種子數)×100%。

發芽率(GR)=(發芽結束后的發芽種子數/供試種子數)×100%。

發芽指數(GI)=∑(Ni/ti)。

活力指數(VI)=GP×(苗高+根長)。

式中:Ni為培養第一天發芽的種子數;ti是從開始到第一次發芽的時間。

1.3.2 生長指標 待辣椒幼苗長至兩葉一心時,選取長勢一致的幼苗,全株采回后立即清洗擦干,用游標卡尺測量株高、根長,先用電子天平稱量幼苗鮮重,然后將樣品置于烘箱105 ℃殺青30 min,隨后轉至80 ℃烘干至恒重,記錄干重。

1.3.3 生理指標 將引發后的辣椒種子及長至兩葉一心的幼苗進行取樣,并測定生理指標。采用硫代巴比妥酸法(Velikova et al., 2000)測定丙二醛(MDA)含量(nmol·g-1),采用Schneider和Schlegel(1981)的方法測定超氧陰離子(O2-)含量(μmol·g-1),采用蒽酮比色法(張璐,2017)測定可溶性糖含量(mg·g-1)、考馬斯亮藍染色法(高俊鳳,2006))測定可溶性蛋白質含量(mg·g-1),采用Wang等(1991)的方法測定抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)和脫氫抗壞血酸(dehydroascorbic acid,DHA)含量(nmol·g-1),采用Nakano和Asada(1981)的方法測定抗壞血酸過氧化物酶活性(ascorbate peroxidase,APX),酶活性以(U·g-1·min-1)表示,采用試劑盒法(北京索萊寶科技有限公司)測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(peroxidase,POD)活性,酶活性以U·g-1表示,采用試劑盒法(北京索萊寶科技有限公司)測定脯氨酸含量(μg·g-1)。

1.4 數據統計與分析

利用SPSS 26.0統計分析軟件處理試驗數據,Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒種子萌發的影響

由表1可知,不同濃度CeO2NPS種子引發處理均能促進鹽脅迫下的辣椒種子萌發, S0.5處理組種子的發芽率最高,比未引發處理組的種子提高了34.59%,并且發芽勢為未引發處理組的12倍。不同數據顯示,CeO2NPS啟動顯著提高發芽指數。在鹽脅迫下,所有的引物濃度似乎都能改善發芽指數、活力指數,S0.5處理組的發芽指數和活力指數均達到最高水平(與未引發處理組組相比分別提高了399.57和7.84)。

表1 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒種子萌發的影響Table 1 Effects of CeO2NPS seed priming on pepper seed germination under salt stress

2.2 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒幼苗生長的影響

由表2可知,適宜濃度CeO2NPS引發處理能促進鹽脅迫下的辣椒幼苗的生長。S0.4處理組的幼苗的鮮重、干重和根長均顯著高于未引發處理組,分別提高了35.75%、135.33%、35.48%,但株高顯著低于未引發處理組,說明種子引發處理能夠顯著促進幼苗根系的生長。

表2 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒幼苗生長的影響Table 2 Effects of CeO2NPS seed priming on growth of pepper seedlings under salt stress

2.3 CeO2NPS種子引發處理后的辣椒種子生理生化變化

2.3.1 CeO2NPS種子引發處理后對辣椒種子氧化應激反應的影響 由圖1可知,S0.5處理組種子的超氧陰離子含量顯著低于未引發處理組,降低了68.54%,但種子的丙二醛含量提高了21.74%,與未引發處理組相比差異不顯著。

不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05). The same below.圖1 CeO2NPS種子引發處理對辣椒種子超氧陰離子和丙二醛含量的影響Fig. 1 Effects of CeO2NPS seed priming on superoxide anion and MDA contents of pepper seeds

由表3可知,S0.5處理組的種子的CAT活性顯著高于未引發處理組,提高了54.06%,但種子POD、APX活性顯著低于未引發處理組,分別降低了44.56%、59.98%;S0.5處理組的種子的AsA含量高于未引發處理組,提高了8.89%,同時,S0.5處理組種子的AsA/DHA比值與未引發處理組相比顯著提高了78.81%。

表3 CeO2NPS種子引發處理對辣椒種子抗氧化酶及抗氧化物質含量的影響Table 3 Effects of CeO2NPS seed priming on antioxidant enzyme activities and antioxidant contents of pepper seeds

2.3.2 CeO2NPS種子引發處理后對辣椒種子可溶性蛋白質、脯氨酸、可溶性糖含量的影響 由表4可知,S0.5處理組種子的可溶性蛋白質和脯氨酸含量顯著高于未引發處理組,分別提高了119.62%和114.50%,但種子的可溶性糖含量與未引發處理組相比無顯著差異。

表4 CeO2NPS種子引發處理對辣椒種子可溶性蛋白質、脯氨酸、可溶性糖含量的影響Table 4 Effects of CeO2NPS seed priming on soluble protein, proline and soluble sugar contents of pepper seeds

2.4 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒幼苗生理生化特征的影響

2.4.1 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒幼苗可溶性蛋白質、脯氨酸、可溶性糖含量的影響 由表5可知,S0.4處理組幼苗的可溶性蛋白質含量顯著高于未引發處理組,提高了20.51%,但幼苗的脯氨酸和可溶性糖含量均顯著低于未引發處理組,分別降低了75.02%和41.16%。

表5 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒幼苗可溶性蛋白質、脯氨酸、可溶性糖含量的影響Table 5 Effects of CeO2NPS seed priming on soluble protein, proline and soluble sugar contents of pepper seedlings under salt stress

2.4.2 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒幼苗氧化應激的影響 由表6可知,S0.4處理組幼苗的CAT、POD、APX、SOD活性均顯著低于未引發處理組, 分別降低了84.92%、 13.58%、 41.33%、61.79%;S0.4處理組幼苗的丙二醛含量低于未引發處理組,降低了20.38%。

表6 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒幼苗抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響Table 6 Effects of CeO2NPS seed priming on antioxidant enzyme activities and MDA contents of pepper seedlings under salt stress

由圖2可知,S0.4處理組幼苗的AsA含量和AsA/DHA比值均顯著高于未引發處理組,分別提高了111.04%和273.77%。

圖2 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒幼苗AsA含量及AsA/DHA比值的影響Fig. 2 Effects of CeO2NPS seed priming on AsA content and AsA/DHA ratio of pepper seedlings under salt stress

3 討論

3.1 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒種子萌發的影響

鹽脅迫通過滲透脅迫使植物細胞體內離子平衡和氧化還原平衡失調,從而產生過量活性氧(reactive oxygen species, ROS),導致細胞脂質過氧化、蛋白質氧化,進而使細胞膜受到損害,最終使種子萌發受到抑制(Zhang et al., 2022)。因此,選擇具有清除ROS能力的試劑來進行種子引發處理是目前較為新興的研究方向之一。研究表明,氧化鈰納米顆粒(CeO2NPS)可以通過清除ROS、提高植物體內抗氧化酶系統等方式促進種子在非生物脅迫下的順利萌發(Lizzi et al., 2020)。

本研究表明,S0.5處理組的辣椒種子引發效果相對較好,提高了鹽脅迫下辣椒種子的萌發速度,進而促進了種子的萌發。本研究發現,S0處理組辣椒種子的發芽率也遠高于未引發處理組, 可能與S0處理組中的MgCl2溶質曾被作為無機的種子引發劑促進甜菜種子的萌發有關(劉曉晗等,2021)。

S0.5處理組種子的丙二醛含量稍高于未引發處理組,表明CeO2NPS種子引發處理可能對種子的氧化應激平衡造成了一定程度的影響,這可能是由于納米毒性引起。但是,S0.5處理組的種子超氧陰離子含量顯著低于未引發處理組,并且脯氨酸、可溶性蛋白質、CAT活性、抗壞血酸(AsA)含量及AsA/DHA比值顯著高于未引發處理組,說明CeO2NPS辣椒種子引發處理影響了種子的生理生化活動。脯氨酸的積累有助于穩定細胞質的滲透平衡、保護細胞免受氧化損傷和保護脅迫相關蛋白的合成(Gui et al., 2015; Noor et al., 2022),進一步提高如CAT的活性,與抗壞血酸-谷胱甘肽循環協同清除過量的活性氧含量,維持細胞的氧化還原穩態,最終減緩鹽脅迫對辣椒種子萌發過程中所造成的細胞脂質過氧化程度,進而維持種子細胞膜的完整,使種子能夠順利發芽,并且其最終發芽率顯著高于未引發處理組,表明CeO2NPS種子引發處理對辣椒種子萌發的促進作用起主導作用,同時也可以證明辣椒種子具有適應CeO2NPS毒性的保護機制。這與Khan等(2021)采用0.1 mmol· L-1CeO2NPS引發處理提高蕓薹種子鹽脅迫下發芽率的研究結果相似,表明CeO2NPS種子引發處理對促進種子非生物脅迫下的萌發具有一定的積極作用,但不同植物的最適濃度不一定相同。

3.2 CeO2NPS種子引發處理對鹽脅迫下辣椒幼苗生長及生理的影響

鹽脅迫通過影響抗氧化系統的建立、抑制蛋白質合成等方式抑制植物的生長發育(Rossi et al., 2016; Hassanpouraghdam et al., 2022)。CeO2NPS已被證明可促進植物的生長發育(Khan et al., 2021)。

本研究表明,S0.4處理組的種子在鹽脅迫下長成的幼苗的鮮重、干重及根系長度均達到了最大值,顯著高于未引發處理組,說明適宜濃度CeO2NPS種子引發處理可促進鹽脅迫下辣椒幼苗的生長。這與 Khan等(2021)用0.1 mmol·L-1CeO2NPS種子引發處理蕓薹種子后,可促進鹽脅迫下蕓薹幼苗的生長發育的研究結果相似。同時,S0.4處理組在鹽脅迫下長成的辣椒幼苗的鮮重、干重及根長均顯著高于S0處理組,說明CeO2NPS種子引發處理對幼苗生長發育的影響作用要優于MgCl2。

鹽脅迫對細胞氧化應激的損傷程度可以通過MDA的產生和積累來識別(Deinlein et al., 2014)。本研究中,S0.4處理組的幼苗在鹽脅迫下的丙二醛含量降低,表明CeO2NPS種子引發處理對減輕辣椒幼苗在鹽脅迫下的脂質過氧化程度有一定的積極作用。同時,幼苗的CAT、SOD活性均降低,可能與CeO2NPS因顆粒表面存在+3/+4氧化還原態比率而使其具有獨特的類抗氧化酶(CAT、SOD)活性有關(Zhao et al., 2012)。

AsA可作為非酶類抗氧化物直接清除ROS,也可與還原型谷胱甘肽(GSH)一起參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(AsA-GSH循環)(Rong et al., 2022)。AsA/DHA比值可反映AsA-GSH循環效率從而用于評價抗氧化能力和衡量植物的抗逆能力(Gao et al., 2022)。本研究表明,S0.4處理組的幼苗在鹽脅迫下的AsA含量及AsA/DHA比值顯著提高,說明CeO2NPS種子引發處理可通過促進幼苗葉片的AsA-GSH循環來維持鹽脅迫下幼苗的氧化應激平衡,這與Gohari等(2021)在75 mmol·L-1NaCl溶液模擬鹽脅迫下,對葡萄(Vitisvinifera)葉片進行葉面噴施CeO2NPS后,可通過促進葡萄葉片的抗壞血酸-谷胱甘肽循環,從而降低葉片ROS含量來緩解鹽脅迫下葡萄葉片的氧化應激反應的研究結果相似。

4 結論

(1)不同濃度CeO2NPS均可促進辣椒種子在鹽脅迫下的萌發,以0.5 mmol·L-1的濃度最佳。

(2)適宜濃度 CeO2NPS種子引發處理后可促進幼苗根系生長和生物量的提高,以0.4 mmol· L-1的濃度最佳。

(3)CeO2NPS種子引發處理后,可通過激發萌發有關酶活性、增加代謝產物等方式提高種子的發芽率,還可通過記憶效應,提高抗氧化物含量、促進ASA-GSH循環從而降低脂質過氧化、緩解氧化應激來提高幼苗的耐鹽性。CeO2NPS可作為一種納米引發劑促進植物在鹽脅迫下的生長發育。