30個靈芝菌株的抗炎活性篩選評價

李 芳, 李浩楠,余夢瑤,賀黎銘,蔡 凌,羅 霞

(四川省中醫藥科學院菌類藥材研究所/菌類藥材系統研究與開發實驗室,成都 610041)

中藥材靈芝為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實體。全年采收,除去雜質,剪除附有朽木、泥沙或培養基質的下端菌柄,陰干或在40～50℃烘干[1]。靈芝是一種應用歷史悠久的傳統中藥,在我國的記載已超過2000年,被歷代醫藥學家認為是滋補強壯、扶正固本的“仙草”,具有補氣安神、止咳平喘的功效,能安心神、健脾胃、益氣血,臨床上多用于治療失眠、神疲乏力、心悸、腫瘤等。現代研究表明,靈芝含有多種化學成分,其中的活性成分以多糖、三萜、核苷、甾醇類為主,具有一定的抗腫瘤、降糖、保肝、抗衰老等活性[2]。

炎癥反應是許多炎癥性疾病的早期癥狀之一,表現為發熱、疼痛、發紅、和腫脹,常見的炎癥性疾病包括皮炎、痛風、關節炎等[3],慢性炎癥可以長時間持續存在,從而引起多種疾病,甚至導致腫瘤的產生。目前,非甾體抗炎藥是治療炎癥性疾病公認的藥物,這些藥物通過抑制環氧化酶(Cyclooxygenase,COX)阻止花生四烯酸代謝為前列腺素E2(PGE2),從而發揮其治療作用,但長期使用非甾體抗炎藥會引起胃腸道反應等毒副作用[4]。因此,尋找安全性高的消炎新藥仍然是炎癥疾病的重要研究方向。靈芝藥用歷史悠久、來源廣泛、毒副作用少,是天然藥物的重要來源之一。近年來,國內外出現了一些關于靈芝抗炎的研究報道,但是研究較少、不夠深入。基于此,本研究擬從靈芝核心種質資源庫的30個靈芝菌株中提取有效成分,并通過體外實驗進行抗炎作用評價,篩選獲得具有良好抗炎效果的靈芝菌株,以期為炎癥藥物開發提供更多的活性原料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 30個靈芝(Ganodermalucidum)菌株資源保藏于四川省中醫藥科學院菌類藥材研究所,子實體按常規的靈芝袋料栽培方法獲得。

1.1.2 實驗細胞 RAW264.7 細胞系購自中國科學院細胞庫(中國上海),由四川省中醫藥科學院菌類藥材研究所傳代保存。

1.1.3 試劑 谷氨酰胺(批號G8540-256)、丙酮酸鈉(批號L101019)購自四川愛得科技有限公司;脂多糖(LPS,貨號L2880)購自美國SIGMA公司;PRMI-1640培養基(貨號:R8755-1L)購自美國SIGMA公司;青霉素-鏈霉素(批號:V900929-100ML)購自上海百研生物科技有限公司;胎牛血清(貨號:C04001-500ML)購自Bovogen 公司;MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍)(批號298-93-1) 購自BIOFROXX公司;萘乙二胺鹽酸鹽(貨號 DC07BA1002)、無水對氨基苯磺酸(貨號 DC5BA0731)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;亞硝酸鈉(NaNO2)、乙醇、NaCl購自成都長聯化工試劑有限公司。

1.1.4 儀器 BB5060UV二氧化碳培養箱(Heraeus公司);TS100熒光倒置顯微鏡(Nikon 公司);Fresco型離心機(SURVALL公司);SW-CJ-1D型潔凈工作臺(江蘇潔凈化設備廠);Multiskan Ascen酶標儀(Thermo公司);LD210-1型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);5810R型高速冷凍離心機(德國 EPPENDORF);DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精密實驗設備有限公司);25cm細胞刮刀(廣州潔特生物過濾股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 靈芝活性成分的提取 靈芝總多糖采用熱水回流提取,料液比為1∶50(靈芝/g:水/mL),提取溫度為100℃,提取時間為1h,提取2次。所得提取液用定性濾紙過濾2次,再用0.45um微孔濾膜過濾1次,并在旋轉蒸發儀上濃縮到70mL左右,在100℃水浴上蒸干,得靈芝總多糖提取物,放于4℃冰箱備用。靈芝總三萜采用乙醇熱回流提取法,料液比為1∶50(靈芝/g∶95%乙醇/mL),保持微沸,提取時間為1h,提取2次。所得提取液用定性濾紙過濾2次,并在旋轉蒸發儀上濃縮到70mL左右,在100℃水浴上蒸干,得靈芝總三萜提取物,放于4℃冰箱備用。

1.2.2 細胞培養與傳代 從液氮罐中取出RAW264.7細胞,復蘇后于含10%胎牛血清、1‰抗生素的PRMI-1640培養基中,置37℃、5% CO2培養箱培養。當細胞生長至培養瓶80%左右時,用細胞刮刀將細胞刮下,于培養液中吹打混勻,按1∶4-6傳代。

1.2.3 RAW264.7 細胞炎癥細胞模型構建及靈芝提取物抗炎活性評價 用不同濃度的LPS(0,2.5,5,10,20,25μg/mL)誘導RAW264.7細胞生成NO構建細胞炎癥模型,同時考察LPS對RAW264.7細胞的毒性,綜合確定LPS的使用濃度。采用Griess法測定RAW264.7 細胞一氧化氮生成量。Griess A液(0.1%萘乙二胺二鹽酸)和 Griess B液(20%溶解在磷酸中的磺胺)等體積混合制備Griess 試劑。以0至100μM 的 NaNO2溶液為標準品,建立標準曲線。培養結束后,從孔板中取100μl上清液,再加100μl Griess試劑,室溫孵育30min。用酶標儀測定孔板在540nm處的光吸收值(OD值)。將RAW264.7細胞以每孔4×104個細胞的密度接種到96孔板中,孵育過夜。次日加入含不同靈芝提取物 (終濃度0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)的培養液預先培養2h,再加入 LPS培養48h以誘導NO生成構建炎癥細胞模型。計算NO抑制率=(對照組平均OD值-給藥組平均OD值)/對照組平均OD值×100%。NO含量和炎癥反應成正相關,以NO抑制率評價靈芝提取物抗炎活性。

1.2.4 靈芝提取物對RAW264.7 細胞毒性的影響 采用MTT法檢測細胞活力以評價靈芝提取物對RAW264.7細胞的毒性影響。將細胞以每孔1×104個細胞的密度接種到96孔板中,培養過夜,次日加入含不同靈芝提取物 (終濃度0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)的培養液持續培養48h。充分作用后,小心吸出孔板中的培養基,每孔加入100μl PBS和 10μl MTT溶液,培養4h后,每孔加入100 μl SDS溶液,孵育過夜。用酶標儀測試孔板在570nm處的光吸收值(OD值)。計算細胞存活率=給藥組平均OD值/對照組平均OD值×100%。

2 結果與分析

2.1 靈芝提取物產率

將30份靈芝種質資源的30個靈芝子實體樣品,按照前述方法分別采用醇提和水提方式,獲得60個實驗樣品,提取率見表1。

表1 靈芝提取物產率統計

2.2 炎癥細胞模型構建

結果表明,不同濃度的LPS(0,2.5,5,10,20,25μg/mL)誘導RAW264.7細胞后,NO生成量均明顯增加,成功誘導形成細胞炎癥,見圖1。MTT實驗結果表明,2.5和5μg/mL LPS對RAW264.7細胞活力無明顯影響,其余高濃度LPS均對RAW264.7細胞活力有顯著抑制作用,見圖2。綜合考慮,本研究確定以2.5 μg/mL LPS作為建立炎癥細胞模型的有效濃度。

圖1 不同濃度LPS對NO釋放量的影響

圖2 不同濃度LPS對細胞活性的影響

2.3 靈芝提取物對NO生成的影響

2.3.1 總三萜對NO生成的影響 試驗結果表明,30個靈芝總三萜提取物對LPS誘導的Raw264.7炎癥模型NO生成有不同程度的抑制作用,除去編號GL154、GL215、GL221、GL222、GL226外,其余25個靈芝總三萜提取物均具有較好的抑制NO生成的作用,抑制率>60%。

2.3.2 總多糖對NO生成的影響 試驗結果表明,28個靈芝總多糖提取物對LPS誘導的Raw264.7炎癥模型NO生成有不同程度的促進作用,僅編號GL220、GL167具有一定的抑制NO生成作用,抑制率<30%。因此30個靈芝總多糖提取物均不具有抗炎作用。

2.4 靈芝提取物對Raw264.7細胞活力的影響

2.4.1 靈芝總三萜對Raw264.7細胞活力的影響 試驗結果表明,30個靈芝總三萜提取物對Raw264.7細胞活力有不同程度的抑制作用,其中編號GL230、GL232、GL234、GL235、GL236、GL237、GL225、GL184靈芝總三萜提取物抑制作用明顯,抑制率>40%。

2.4.2 靈芝總多糖對Raw264.7細胞活力的影響 試驗結果表明,30個靈芝總多糖提取物對Raw264.7細胞活力有不同程度的抑制或促進作用,其中編號GL227、GL229、GL232、GL234、GL235靈芝總多糖提取物促進增殖作用明顯,促進率>40%。

3 討論與結論

靈芝是我國常用的傳統名貴中藥材,已有3000多年的藥用歷史,具有扶助正氣、滋補強壯的功效。靈芝資源在我國分布范圍很廣,北到黑龍江,西到新疆,南到云南,廣東等地均有靈芝的存在,其中江西、福建、廣東是我國靈芝資源的主產區,我省也有豐富的野生資源[5-8]。現代藥理研究表明,靈芝具有抗腫瘤、免疫調節、降血糖、降血脂、抗氧化等藥理作用。近年來,有研究發現靈芝還具有一定的抗炎作用[9-10]。本研究開展不同靈芝菌株的抗炎活性篩選,以期篩選獲得具有較好抗炎活性的靈芝菌株,拓寬靈芝應用方向,提高對靈芝資源的利用度。三萜和多糖是靈芝的主要活性成分,本研究首先通過乙醇提取和水提取的方法分別獲得了靈芝總三萜和總多糖,結果表明不同靈芝菌株子實體中的總三萜和總多糖提取得率不同,活性成分含量各有差異。LPS刺激小鼠RAWA264.7細胞炎癥模型是體外研究炎癥常用的細胞模型[11],NO是炎癥反應中釋放的常見炎癥因子,可作為評價抗炎活性的實驗依據[12],適用于類似本研究的大量樣品抗炎活性篩選,采用此法能快速獲得篩選結果。同時樣品對RAWA264.7細胞的毒性作用也是重點考察指標[13]。綜合分析,30個靈芝總多糖提取物都不具有抗炎活性;編號GL219、GL 167靈芝菌株的總三萜提取物在濃度為12.5 μg/mL下,兼具抗炎活性良好(NO抑制率>60%)、無細胞毒性的優點,可作為進一步篩選的抗炎原料。