雙配體金納米簇?zé)晒馓结樀闹苽浼胺€(wěn)定性研究

基金項目：國家自然科學(xué)青年基金項目（22302180）；河南省高等學(xué)校重點項目（24B150042）；鄭州工程技術(shù)學(xué)院科研啟動項目（22093）；鄭州工程技術(shù)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（202311068A014）

作者簡介：孟飛飛（1986—），女，河南洛陽人，博士，鄭州工程技術(shù)學(xué)院食品與化工學(xué)院講師，研究方向為納米探針的制備及功能研究。

摘 要：采用雙蛋白為模板，以BSA和FIC兩種蛋白為還原劑和穩(wěn)定劑制備出具有紅色熒光的金納米簇（AuNCs）熒光探針，考察了不同的反應(yīng)物濃度、反應(yīng)時長、反應(yīng)溫度、NaOH用量等條件對制備AuNCs的影響。對反應(yīng)前后樣品的紫外光譜、紅外光譜、圓二色光譜和熒光光譜進行分析，證實了AuNCs熒光探針的形成。實驗結(jié)果表明，此探針在pH3～pH12的緩沖溶解中熒光強度較為穩(wěn)定，在NaCl溶液濃度為20 mM～400 mM的范圍內(nèi)也具有良好的熒光強度穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：金納米簇；牛血清白蛋白；無花果蛋白酶；熒光探針

DOI：10.13783/j.cnki.cn41-1275/g4.2024.06.021

中圖分類號：O657.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1008-3715（2024）06-0123-06

金納米團簇通常是一個相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可以由幾個原子組成，也可以由幾百個金原子構(gòu)成，其尺寸一般在2 nm以下^［1］，不同的原子數(shù)目也會使它們在紫外燈照射下發(fā)出不同的熒光。在最近的幾十年間，金納米團簇由于其優(yōu)異的穩(wěn)定性，在光學(xué)、電學(xué)、物理、化學(xué)、催化等方面有獨特特性，并且具有低毒性、良好的發(fā)光性及生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)、傳感器、成像和催化領(lǐng)域有良好的發(fā)展前景^［2-7］。

蛋白質(zhì)為模板合成金納米簇在金納米簇的制備方法研究方面擁有重要地位。2009年，Xie等^［8］首次以牛血蛋白（BSA）為模板制備出紅色熒光的AuNCs，其操作方法非常簡單，只需要將BSA溶液與氯金酸溶液在堿性條件下進行混合。反應(yīng)過程中，在pH12的條件下牛血清白蛋白中還原性的酪氨酸、色氨酸和苯丙胺酸質(zhì)可以將氯金酸溶液還原為金原子，從而獲得具有紅色熒光的AuNCs。這個結(jié)論為蛋白質(zhì)合成AuNCs的研究提供了思路，拓寬了研究領(lǐng)域。王賽男^［9］在此基礎(chǔ)上對BSA制備金納米簇進行另一種嘗試，水浴100℃，加熱3 min制備出了AuNCs，發(fā)現(xiàn)其在檢測茶多酚時表現(xiàn)出較高的靈敏度。魏春豪等^［10］也利用同樣的方法將10 mL的BSA溶液與10 mL的HAuCl₄溶液混合，37℃進行磁力攪拌2 min后加入1 M的NaOH溶液，將溫度升到100℃反應(yīng)7 min即制備出AuNCs。周秋敏等^［11］將BSA和HAuCl₄溶液在40℃下攪拌2 min后，再加入NaOH調(diào)節(jié)溶液為弱堿性，繼續(xù)反應(yīng)12 h制備出AuNCs，基于熒光猝滅效應(yīng)完成對蘆丁的檢測。然而，這些合成方法反應(yīng)時長較長，原料成本較高，不利于大批量的生產(chǎn)應(yīng)用。本文采用雙蛋白為模板，以BSA和FIC兩種蛋白為還原劑和穩(wěn)定劑制備出了具有紅色熒光的AuNCs熒光探針。原料簡單易得，方法綠色環(huán)保，制備的紅色熒光探針具有較好的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

氯金酸（HAuCl₄·4H₂O）、牛血清白蛋白（BSA）、無花果蛋白酶（FIC）：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；PBS緩沖溶液由0.1 M鹽酸、0.1 M氫氧化鈉、0.1 M磷酸氫二鈉和0.1 M磷酸二氫鈉制備。所有試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 主要儀器與設(shè)備

FluoroMax+熒光光譜儀：日本HORIBA公司；Cary 60紫外可見分光光度計：安捷倫科技有限公司；Spectrum傅里葉變換紅外光譜分析儀：Perkin Elmer公司；J-1500圓二色分光光度計：日本JASCO公司；Milli-Q Advantage A10超純水裝置。

1.3 實驗方法

1.3.1 AuNCs的制備

向25 mL的圓底燒瓶中加入2 mL 5 mM氯金酸并快速攪拌，隨后加入1 mL的BSA（25 mg/mL）溶液和1 mL的FIC（25 mg/mL）溶液，迅速加入600 μL的NaOH（1 M）溶液在60℃的油浴鍋中加熱并持續(xù)攪拌25 min至充分反應(yīng)。反應(yīng)過程中觀察到溶液由淺黃色變?yōu)槌赛S色時，將其放在紫外燈下照射，溶液顏色發(fā)出強烈的粉紅色熒光，表明AuNCs成功制備。將AuNCs溶液在10000 rpm/min的高速離心機中離心2次，每次10 min，得到純化后的AuNCs溶液（4℃下避光保存?zhèn)溆茫１緦嶒炛兴胁Ａx器均用王水浸泡和超純水洗滌。

1.3.2 表征方法

熒光光譜：取適量的AuNCs溶液于熒光石英皿中，使用熒光分光光度計測定在激發(fā)波長為492 nm，發(fā)射波長為512～900 nm，狹縫為1GA6FA3時的最大發(fā)射波長和相應(yīng)的熒光強度，得到熒光光譜圖。

紫外-可見吸收光譜（UV-vis）：分別取適量的HAuCl₄，BSA，F(xiàn)IC和制備完成的AuNCs溶液于紫外可見分光光度計的石英皿中，在200～800 nm范圍內(nèi)進行掃描，得到紫外可見吸收光譜圖。

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）：取少量AuNCs固體和一定量的KBr粉末放入研缽中研細，再用紅外壓片機制成透明的薄片，在4000～400 cm^-1范圍內(nèi)進行掃描，得到AuNCs的紅外光譜圖。

圓二色光譜（CD）：分別取適量的BSA，F(xiàn)IC和AuNCs溶液于圓二色光譜儀的石英皿中，在190～260 nm范圍內(nèi)進行掃描得到AuNCs的圓二色光譜圖。

1.3.3 AuNCs制備工藝優(yōu)化

氯金酸濃度對AuNCs的影響：保持其他條件不變，氯金酸濃度分別為2.5， 5，7.5 和10 mM，按照1.3.1的方法制備AuNCs，并掃描熒光強度。

BSA濃度：保持其他條件不變，BSA濃度分別為8，12.5，25，50和75 mg/mL，按照1.3.1的方法制備AuNCs，并掃描熒光強度。

FIC濃度：保持其他條件不變，F(xiàn)IC濃度分別為25，50和75 mg/mL，按照1.3.1的方法制備AuNCs，并掃描熒光強度。

NaOH體積：保持其他條件不變，1 M氫氧化鈉用量分別為100，200，300，400，500，600和800 μL，按照1.3.1的方法制備AuNCs，并掃描熒光強度。

反應(yīng)時間：保持其他條件不變，反應(yīng)時間分別為5，10，15，20，25，30和35 min，按照1.3.1的方法制備AuNCs，并掃描熒光強度。

反應(yīng)溫度：保持其他條件不變，反應(yīng)溫度分別為室溫以及37，50，60，80和100℃，按照1.3.1的方法制備AuNCs，并掃描熒光強度。

1.3.4 AuNCs性能測試

為考察AuNCs在不同環(huán)境中熒光性能穩(wěn)定性，通過監(jiān)測其在不同環(huán)境放置一段時間后的熒光強度變化進行衡量。將其放在不同溫度（室溫以及37，45，55，65，75，85和95℃），pH（3，4，5，6，7，7.4，8，9，10，11和12），NaCl濃度（20，40，80，120，160，200，300和400 mM）的對應(yīng)環(huán)境中，靜置5 min，通過測試其熒光強度來確定AuNCs穩(wěn)定性最好時的溫度、pH值和NaCl濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNCs的表征

2.1.1 熒光光譜分析

AuNCs的熒光光譜表征如圖1所示，設(shè)定AuNCs激發(fā)波長分別為405，422，432，442，452，462，472，482和492 nm來確定其最大的發(fā)射波長，得到的數(shù)據(jù)如圖1a所示。當(dāng)激發(fā)波長持續(xù)變化時，相應(yīng)的發(fā)射波長并未發(fā)生變化，在激發(fā)波長為492 nm的情況下AuNCs的熒光強度最高。最終確定AuNCs的最佳激發(fā)波長為492 nm，最佳的發(fā)射波長為660 nm。如圖1b所示，與只采用BSA制備的AuNCs相比采用雙蛋白制備的AuNCs最大發(fā)射波長發(fā)生了23 nm的藍移，這可能是由于半胱氨酸殘基和蛋白質(zhì)之間的強親和力以及FIC導(dǎo)致BSA的二級結(jié)構(gòu)變得剛性^［12］。

2.1.2 紅外光譜分析

AuNCs，BSA，F(xiàn)IC的紅外光譜。BSA在1653.92 cm^-1處出現(xiàn)吸收峰，F(xiàn)IC在此處并沒有出現(xiàn)吸收峰，而制備的AuNCs在1653.36 cm^-1處有一個吸收峰，則表明BSA參與了AuNCs的制備。FIC在3382 cm^-1處出現(xiàn)吸收峰，這是由FIC的N-H基團和O-H基團^［13］的伸縮振動引起的。在1415 cm^-1和1050 cm^-1處的吸收峰是由C-H的彎曲振動和FIC的C-O的拉伸振動引起的^［14］。而制備出來的AuNCs光譜中在這些位置也發(fā)現(xiàn)了類似的吸收峰，這表明AuNCs受到了FIC的保護，表明FIC也參與了AuNCs的制備。

2.1.3 紫外可見光譜表征

反應(yīng)中HAuCl₄，BSA，F(xiàn)IC的紫外光譜光譜如圖2所示。BSA和FIC在280 nm處出現(xiàn)了最大吸收峰，這可能是蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸等含共軛雙鍵的芳香族氨基酸在這里具有吸收峰的特性^［8］。HAuCl₄溶液在300 nm附近出現(xiàn)了最大吸收峰，可能是因為來自Cl到Au的電子躍遷^［15］，通過觀察制備的AuNCs的紫外吸收譜圖發(fā)現(xiàn)BSA溶液和FIC溶液在280 nm附近產(chǎn)生的苯環(huán)特征吸收峰消失了，并且可以直觀地發(fā)現(xiàn)在520 nm附近并沒有產(chǎn)生紫外特征吸收峰，說明在制備過程BSA和FIC的芳香族氨基酸參與了反應(yīng)。同時也說明了制備的金納米材料主要為小尺寸的AuNCs，并沒有形成粒徑較大的顆粒。

2.1.4 圓二色光譜（CD）分析

AuNCs，BSA，F(xiàn)IC的CD圖如圖2所示。觀察發(fā)現(xiàn)BSA和FIC在208 nm和222 nm處表現(xiàn)出兩個負(fù)的特征峰，說明BSA和FIC均為α-螺旋結(jié)構(gòu)，但制備出來的AuNCs只有在201 nm處出現(xiàn)了特征峰，而在208 nm和222 nm處并沒有特征峰，說明在合成的過程中BSA和FIC的構(gòu)象發(fā)生了變化^［16］，也更好地說明這兩種蛋白都參與了AuNCs的制備。

2.2 影響AuNCs熒光強度的因素

2.2.1 反應(yīng)物濃度

1）HAuCl₄濃度的影響：HAuCl₄濃度對AuNCs的熒光影響結(jié)果如圖4a所示。從圖4a中可知，HAuCl₄濃度在5 mM 時，制備出的AuNCs熒光強度最高，使用較低或較高濃度HAuCl₄都會導(dǎo)致AuNCs熒光強度下降。因此，確定實驗中5 mM為HAuCl₄的最佳使用濃度。

2） BSA濃度的影響：BSA濃度對AuNCs的熒光影響結(jié)果由圖3b所示。可知當(dāng)BSA濃度為8和12.5 mg/mL時制備的AuNCs熒光強度明顯較弱，而50 mg/mL的BSA制備的AuNCs的熒光強度明顯最強。在合成過程中，BSA濃度既不能過高也不能過低，當(dāng)BSA濃度過低時，AuNCs熒光強度明顯降低，甚至失去熒光效應(yīng)。當(dāng)BSA濃度過高時，AuNCs熒光強度相比較BSA濃度為50 mg/mL 時有所降低，且隨著濃度過高，在激發(fā)為492 nm下，掃描的AuNCs最大發(fā)射波長發(fā)生明顯紅移，說明隨著BSA濃度增大，BSA在反應(yīng)中起著主導(dǎo)作用。因此，確定實驗中BSA的最佳使用濃度為25 mg/mL。

3） FIC濃度的影響：FIC濃度對AuNCs的熒光影響結(jié)果如圖4c所示。FIC濃度在25 mg/mL時熒光強度最高，且當(dāng)FIC濃度過低或過高時，相較于使用量25 mg/mL時熒光強度都降低。綜合考慮，確定實驗過程中FIC的最佳使用濃度為25 mg/mL。

2.2.2 NaOH體積

改變NaOH溶液提體積并記錄加入NaOH后溶液的pH值，結(jié)果如圖5a所示。氫氧化鈉用量在100 μL時，溶液pH值為8，呈弱堿性且AuNCs最大發(fā)射波長為559 nm，而用量在200～800 μL時溶液的pH值為12～13，呈強堿性且最大發(fā)射波長變化幅度不大。由圖顯示，隨著NaOH用量的增加，制備的AuNCs熒光強度逐漸增加。當(dāng)NaOH用量為600 μL時熒光強度達到最大值，NaOH用量為800 μL時熒光強度開始減弱，因此本實驗NaOH的最佳用量為600 μL。

2.2.3 反應(yīng)時間

反應(yīng)時間結(jié)果如圖5b所示，AuNCs熒光強度隨著反應(yīng)時間增加逐漸增強，并在25 min時達到最大值，在25 min之后，隨著時間增加，AuNCs熒光強度逐漸減弱。因此，25 min為本實驗最佳反應(yīng)時間。

2.2.4 反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度如圖5c所示，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)溫度為37℃和60℃時得到的AuNCs具有較高的熒光強度。但是，反應(yīng)溫度為37℃時，制備AuNCs需要12 h，而60℃下AuNCs的制備時間只需要25 min，為節(jié)省時間，此實驗選用的反應(yīng)溫度為60℃。

2.3 AuNCs的熒光性能

2.3.1 孵育溫度對AuNCs的影響

將制得的AuNCs放在室溫以及37，45，55，65，75，85和95℃環(huán)境下，通過測定AuNCs的熒光強度得到不同的熒光光譜圖。如圖6所示，在室溫下，AuNCs的熒光強度明顯最強，且隨著溫度的升高，AuNCs熒光強度在逐漸降低。由此可見，AuNCs不具備耐高溫特性。

2.3.2 pH對AuNCs的影響

向制得的AuNCs中分別加入pH值為3，4，5，6，7，7.4，8，9，10，11和12的緩沖溶液，通過測定其熒光強度與原始熒光強度之比得到不同的熒光強度圖。如圖7所示，AuNCs在pH3～pH7的環(huán)境中熒光強度有略微的上升，而在pH7.4～pH12的環(huán)境中熒光強度較為穩(wěn)定，證明AuNCs在不同的pH溶液中有一個較好的應(yīng)用前景。

2.3.3 NaCl濃度對AuNCs的影響

向AuNCs中加入不同濃度的NaCl（20，40，80，120，160，200，300和400 mM），并測定其熒光強度與原始熒光強度之比，得到不同NaCl濃度的熒光光強度圖。如圖8所示，AuNCs在NaCl溶液濃度為20～200 mM的范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，當(dāng)濃度繼續(xù)增高可以發(fā)現(xiàn)其熒光強度比在下降，說明AuNCs在低濃度的NaCl溶液中較為穩(wěn)定，而在高濃度溶液中不穩(wěn)定。

3 結(jié)論

以BSA和FIC為雙模板，以HAuCl₄溶液為原料，制備了具有紅色熒光的AuNCs。采用紫外可見分光光度計、傅里葉變換紅外光譜儀、圓二色光譜儀和熒光光譜儀進行結(jié)構(gòu)及性能分析，證明成功制備了雙配體金納米簇?zé)晒馓结槨Ｍㄟ^優(yōu)化反應(yīng)物濃度、NaOH用量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度，最終確定以5 mM HAuCl₄，25 mg/mL FIC，25 mg/mL BSA，600 μL 1 M NaOH在60℃下反應(yīng)25 min時制備出雙配體AuNCs。通過改變孵育溫度、pH值、NaCl濃度，得出AuNCs的特性是：不耐高溫、熒光強度在酸性環(huán)境中略有增強，在堿性的環(huán)境中較為穩(wěn)定、具有較高的耐鹽穩(wěn)定性。

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（責(zé)任編輯 李玉玲）

Study on the Preparation and Stability of Dual-Ligand Gold Nanoclusters Fluorescent Probes

MENG Feifei，YAO Hong，SUN Yahao，DUAN Bingchao，ZHANG Wenmin

（School of Food Science and Chemical Engineering， Zhengzhou University of Technology， Zhengzhou， Henan 450044， China）

Abstract：In this paper， gold nanoclusters （AuNCs） fluorescent probes with red fluorescence were prepared by using double protein as template， with BSA and FIC as reducing agent and stabilizer. The effects of different reactant concentration， reaction time， reaction temperature and the amount of NaOH on the preparation of AuNCs were investigated. The UV spectra， infrared spectra， circular dichroism spectra and fluorescence spectra of the samples before and after the reaction were analyzed， and the formation of AuNCs fluorescent probes was confirmed. The experimental results show that the fluorescence intensity of the probe is stable in the buffer solution of pH3～pH12， and it also has good stability in the range of 20～400 mM NaCl solution.

Key words：gold nanoclusters; bovine serum albumin; fig protease; fluorescent probes