食源性阪崎腸桿菌檢測方法研究進展

鄧麗萍 鄧訪萍 張琴

摘 要：阪崎腸桿菌可感染嬰幼兒，引發腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結腸炎。因此，探究出快速、靈敏、高效的阪崎腸桿菌檢測方法對于保障食品質量安全至關重要。目前，阪崎腸桿菌的檢測方法中比較常見的是分離鑒定法、分子生物學檢測技術和免疫學檢測法。分離鑒定法易于操作、成本低，但檢測周期長，無法滿足對目標食品快速檢測的需求；分子生物學檢測技術是一種高靈敏度和特異性的檢測手段，但是由于其對檢測人員要求高，所需設備和試劑價格昂貴，目前多在實驗室進行，不適用于現場檢測；免疫學檢測方法簡單快捷，適用于現場快速檢驗，但容易受到其他雜菌的影響，敏感性較低。本文綜述了分離鑒定法、分子生物學檢測技術、免疫學檢測技術等多種阪崎腸桿菌的檢測方法，結合參考文獻就檢測研究進展予以分析，以期為食品中阪崎腸桿菌的快速檢測方法研究提供參考。

關鍵詞：阪崎腸桿菌；檢測方法；研究進展

Research Progress in Detection Methods for Foodborne Enterobacter sakazakii

DENG Liping1，2，3， DENG Fangping4， ZHANG Qin1，2，3

（1.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station， Guangzhou 511442， China;

2.Guangdong Food Industry Institute Limited Company， Guangzhou 511442， China;

3.Guangdong Provincial Food Industry Public Laboratory， Guangzhou 511442， China;

4.The First Hospital of Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510080， China）

Abstract： Trace amounts of E. sakazakii can infect newborns and young children， causing meningitis， septicaemia and necrotising small bowel colitis， among others. Therefore， exploring a rapid， sensitive and efficient detection method for E. sakazakii is essential for ensuring food quality and safety. At present， conventional isolation and identification， molecular biology and immunological detection methods for E. sakazakii are more common. The separation and identification method is easy to operate and low cost， but the detection cycle is long， which can not meet the demand for rapid detection of target food. Molecular biotechnology is a highly sensitive and specific means of detection， but due to its high demand for test technicians， the required equipment and reagents are expensive， and is currently mostly carried out in the laboratory， is not suitable for on-site testing. The method of immunological determination is simple and fast， which is suitable for field rapid detection， but it is easy to be interfered with other miscellaneous bacteria and its sensitivity is not high enough. In this paper， separation and identification method， molecular biological detection techniques， immunological detection techniques and other detection methods of E. sakazakii were reviewed， and the research progress of detection was analyzed in combination with references， in order to provide reference for the rapid detection of E. sakazakii in food.

Keywords： Enterobacter sakazakii; detection method; research progress

阪崎腸桿菌（又稱阪崎氏腸桿菌）是一種寄生于人和動物腸道內的條件致病菌，在自然界中分布廣泛，具有一定的耐熱性、耐干燥性、耐高滲環境性，可抵抗超高溫瞬時滅菌。奶粉被認為是其主要的傳播途徑，微量的阪崎腸桿菌（≥3 CFU/100 g）就可能導致感染的發生，可引發新生兒腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結腸炎等病癥，甚至會導致嚴重的神經系統后遺癥和發育障礙。來自美國FDA的監測表明，在美國出生體重偏低的新生兒中，阪崎腸桿菌感染率為8.7/10萬；而1歲以下嬰兒阪崎腸桿菌感染率為1/10萬，感染死亡率為20%～50%，1961—2003年全球有案可查的48起嬰兒感染事件中，有25起是新生兒感染[1]。因此，探究出一種快速靈敏、簡便高效的檢測阪崎腸桿菌的方法至關重要。目前阪崎腸桿菌的檢測方法主要有分離鑒定法、分子生物學檢測技術、免疫學檢測技術等[2]。本文將對上述檢測方法的研究進展進行對比分析，為建立更加敏感、高效的阪崎腸桿菌檢測方案提供參考。

1 分離鑒定法

由于受生物化學、形態等方面的限制，目前國內外對阪崎腸桿菌的分離鑒定主要采用國際標準化組織（International Organization for Standardization，ISO）及食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）規定的方法。2008年我國也制定了阪崎腸桿菌的檢驗標準，2016年又進行了修正，規范了阪崎腸桿菌的檢測[3]。除了這些典型的檢測方法，還有在FDA法基礎上改進的DFI法，擬以5-溴-4-氯-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷（XαGLC）為發色團，以α-葡萄糖苷酶為底物，通過水解XαGLC，使其呈現特殊的藍綠色[4]。此外，國內外學者也嘗試使用一些相對快速的傳統檢驗方法進行阪崎腸桿菌檢測。例如，李潔莉等[5]采用VITEK全自動微生物鑒定系統對阪崎腸桿菌人工污染的嬰兒配方乳粉進行檢測，把30種生化反應培養基固定到鑒定卡上，依據細菌在鑒定卡各種生化反應孔中生長變化情況，利用數值法判斷、針對性識別；宋春美等[6]利用試劑盒實現了乳粉中阪崎桿菌的污染檢測等。阪崎腸桿菌的分離與鑒別方法存在耗時長、不易區分、易產生“假陽性”等問題，盡管經過改進，其檢出速度及特異性均得到了提高，但仍然存在難以區分的問題。

2 分子生物學檢測技術

2.1 單重PCR

聚合酶鏈式反應檢測技術（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種比較成熟的分子生物學技術，它以細菌特有的毒性基因為模板，通過擴增目標基因實現對阪崎腸桿菌的快速檢測。在2003年，KEYSER等[7]首次報道了用基因設計引物序列對阪崎腸桿菌進行PCR擴增檢測，這一方法是根據16S rRNA基因序列來設計引物的。

2.2 多重PCR

多重PCR是通過在同一個PCR系統中添加兩對或多對引物，實現多個目標基因的同步檢測。采用多重PCR方法，通過將不同的引物加入相同的PCR反應中，即可實現對多個病原體的同時檢測，并對特定的致病基因進行鑒定，從而極大地提高檢測效率。為減少單重PCR可能造成的假陽性結果的出現，葉應旺等[8]基于阪崎腸桿菌，構建了一種以α-1，4-葡萄糖苷酶及OmpA為標靶的雙重PCR法，用于快速、準確地測定阪崎腸桿菌。為了提高PCR結果的準確性，ZHOU等[9]利用固定化技術，構建了一種能同時測定3 CFU·mL-1目標菌含量的多重PCR體系。與單重PCR相比，采用雙重PCR檢測阪崎腸桿菌的方法雖然靈敏度可能有所降低，但可實現快速、準確測定，提高了檢測結果的準確性。梁會營等[10]以阪崎腸桿菌ompA基因和金葡菌nuc基因為研究對象，采用雙重PCR技術，獲得282 bp、482 bp的兩個擴增片段；侯殿東等[11]基于阪崎腸桿菌ompA基因、沙門氏菌屬侵襲性抗原（invA），建立了能同步檢測阪崎腸桿菌與沙門氏菌的雙重PCR方法；李洋洋等[12]對反應系統進行了優化，設計3對引物用于多重PCR擴增，實現了對嬰兒乳粉中阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌的同時測定。

2.3 熒光定量PCR

美國PE公司于1995年提出了一種核酸定量方法，即通過設計特定的熒光標記探針，或將熒光染料引入反應系統中，對PCR反應中的放大產物進行跟蹤檢測，并利用熱分解曲線軟件對擴增產物進行檢測，獲得最優的模板濃度。PCR檢測不僅可以定性，還可以定量。相對于傳統PCR，熒光定量PCR具有檢測模板數目精確、動力學范圍大、敏感性高等優點，可實現對DNA片段存在與否的判定，同時還能測定DNA的拷貝數，進行定量檢測，而傳統PCR僅能實現半定量；此外，因為PCR是在反應管內進行的，所以熒光定量PCR的研究樣品被污染的概率大大降低，也無須通過瓊脂糖凝膠電泳來評估，節省了許多操作時間，提高了實驗效率。不過，熒光定量PCR也有其局限性，即不能區分是否停止發育和失去活性的細菌。但也不能只關注熒光定量PCR的局限性，就忽略它的特異性，因其特異性，熒光定量PCR已廣泛應用于食源性病原菌的檢測[13]。SEO等[14]針對阪崎腸桿菌大分子合成操縱子基因，確定了實時熒光PCR法檢測阪崎腸桿菌的可行性。利用該技術應用于臨床樣本中，對目標菌進行檢驗，均未出現任何錯誤性的結果，表明其準確性高。2011年，FDA將該方法定為篩選和確認嬰兒奶粉中阪崎腸桿菌的一種有效檢驗方法[15]。

2.4 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術是Notomi于2000年提出的一種核酸放大方法，其基本原理是在目標基因6或8位點上設計4或6個引物，采用替換鏈DNA聚合酶，使其在恒溫條件下1 h即可實現擴增，并根據熒光顏色及渾濁度的變化判斷其結果[16]。賀楠等[17]、胡連霞[18]和張宏偉等[19]分別根據阪崎腸桿菌16S rRNA、ITS序列等特異基因，設計出相應的LAMP引物，建立了一種靈敏的LAMP快速檢測技術。實驗證明，該方法具有較高的特異性和敏感性，操作簡單，便于推廣。近年來，LAMP技術在疾病診斷、食品安全方面都得到了廣泛應用[20]。

2.5 核酸探針技術

2.5.1 熒光原位雜交技術

熒光原位雜交（Fluorescence in Situ Hybridization，FISH）是一種將細胞原位雜交和熒光相結合的新方法。基于阪崎腸桿菌的16S rRNA基因，ALMEIDA等[21]利用熒光原位雜交方法，構建了多肽核酸分子探針，實現了對嬰兒奶粉中阪崎腸桿菌的高靈敏、高特異的快速檢測。熒光原位雜交技術彌補了PCR技術無法區分死菌活菌的不足，理論上僅能檢測出活菌，且無須從模板DNA中提取，操作簡便。同樣基于阪崎腸桿菌的16S rRNA基因，VermiconAG公司也設計了一種特殊的熒光標記的基因探針，并將其商品化。

2.5.2 基因芯片

基因芯片技術的原理是通過目標物與已知序列的核酸探針雜交，然后用熒光探測器掃描該信號，從而得到檢測結果。基因芯片可分為寡核苷酸和cDNA兩種芯片。基于6種阪崎腸桿菌的 ITS 測序序列及GenBank測序結果，LIU等[22]以ITS為目標片段，設計2對引物，10個探針，選擇性富集，檢測限可達

1.3 CFU/100 g。該檢測技術具有高通量、操作簡單快捷、特異性強以及靈敏度高等優點，但是技術復雜、設備價格高、檢測限較高、檢測重復性差以及應用分析范圍窄這些問題還有待解決。

3 免疫學檢測方法

免疫學檢測是憑借抗原與抗體結合的特異性，對目標物進行定性與定量分析，具有操作簡單、靈敏度高、速度快，可同時測定多個樣本等特點。免疫磁珠富集法、ELISA法、免疫熒光法、免疫熒光法以及免疫傳感法等是免疫學研究的熱點。

3.1 免疫磁性微球珠富集技術

免疫磁性微球珠富集技術是通過在磁性微球表面修飾特定抗原（或抗體），使待測樣品與其發生特異性反應，通過磁分離，實現對樣品的富集。金燕飛等[23]采用陽離子磁珠捕集法對乳粉中阪崎腸桿菌進行了分析，并將其與磁性微球進行偶聯，利用磁珠捕獲技術實現了對乳粉中阪崎腸桿菌的同步富集，從而縮短了檢測時間，提高了對該菌株的檢測效率。

3.2 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）利用抗原（抗體）可以吸附在固相載體上，使其具有一定的免疫活性，而當檢測對象被添加到固相載體表面吸附的抗體或抗原中時，則會與這抗原或抗體發生作用，使其發生變色，從而實現對檢測對象的定性或定量分析，包括直接ELISA、雙抗夾心ELISA、dot-ELISA等。汪琳等[24]制備了抗阪崎腸桿菌單克隆抗體，并初步建立了ELISA檢測方法。石曼[25]通過間接ELISA初步研究了阪崎腸桿菌的酶聯免疫分析方法，也制備了高效價、高特異性的阪崎腸桿菌多克隆抗體。相對于常規的培養檢測方法，ELISA方法快速、靈敏、特異，為食品檢驗及臨床診斷提供了一種新方法，有很好的應用前景。

3.3 免疫熒光技術

免疫熒光技術的原理是在抗原（或抗體）上標記一種熒光染料，當被檢測物與該抗原（或抗體）發生特異作用時，該復合物上就會出現一種熒光物質，通過觀察該熒光物質的存在與否，可以判定該抗原或抗體有沒有發生特異結合。支援等[26]利用具有特殊光學性質的量子點作為熒光染料，標記免疫磁珠富集阪崎腸桿菌，建立了一種快速檢測阪崎腸桿菌的新方法，該方法的整個檢測過程僅需要2 h，檢測限約為100 CFU·mL-1。

3.4 電化學免疫傳感器技術

電化學免疫傳感器技術是利用抗體與抗原反應的特異性，將這相互作用轉換在電化學傳感元件上，利用電感元件將被檢測物的濃度信號轉化成對應的電信號，從而檢測和分析被測物。趙廣英等[27]以阪崎腸桿菌為研究對象，制備了一種新型的具有高靈敏度、高選擇性、高穩定性且成本低的免疫電極，并將其用于阪崎腸桿菌的檢測，為阪崎腸桿菌的快速檢測提供了一種新方法。

4 其他技術

隨著檢測技術的發展，對阪崎腸桿菌的檢測已經形成了多種檢測手段，還出現了自動化的檢測體系，使得阪崎腸桿菌的檢測更加便捷、準確和可靠。IVERSEN等[28]通過16S rRNA測序及生物化學特性分析，發現ANN在表型及基因型區分阪崎腸桿菌及近緣細菌的準確率達99.3%，但其分子機制尚不清楚。通過ANN方法對其他具有α-葡萄糖苷酶陽性的阪崎腸桿菌及其他具有α-葡萄糖苷酶活性的菌株進行比較，發現16S rRNA的鑒定準確率可達98.7%，且能獲得準確的生物化學特性分析結果。趙紅陽等[29]采用基質輔助激光解析-飛行時間質譜技術，對40株阪崎腸桿菌及1株陰溝腸桿菌進行了測定，其中阪崎腸桿菌包括38株野生阪崎腸桿菌和2株標準菌株。歐靜堃[30]制備以阪崎腸桿菌為抗原的膠體金免疫層析試紙條，并以此構建了檢測阪崎腸桿菌的快速檢測方法。除此之外，還有很多方法可以用于阪崎腸桿菌的檢測，包括隨機擴增多態性DNA、質粒以及核糖核酸分型等。

5 結語

阪崎腸桿菌常規檢測技術所需測試費用較低，對操作者的要求較低，但耗時長、準確度和特異度較低，易產生假陰或假陽性結果，無法滿足快速檢測的要求。分子生物學檢測技術具有靈敏度高、特異性強等優點，但其對技術人員要求很高，所需的試劑及設備也比較昂貴，多在實驗室中使用，不適于現場檢驗。免疫學分析技術簡單、快速，特別是免疫層析試紙條便于攜帶，適用于現場快速檢測，但是容易受到其他雜菌的影響，且靈敏度較低。阪崎腸桿菌的檢測方法各有利弊，但隨著科技的不斷進步和各學科的交叉融合，各種方法的聯合應用將會是今后阪崎腸桿菌快速檢測的一個重要方向。

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