關(guān)于光合色素的提取、分離及其吸光度的探究

楊運(yùn)昕 趙映蕾 朱冰瀅 鄭歡珂 朱雪瀅

浙江省寧波市效實(shí)中學(xué)白楊校區(qū)(315012)

高中生物必修1進(jìn)行了光合色素的提取和分離實(shí)驗(yàn),通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察光合色素的種類和顏色。出于對(duì)光合色素的興趣,在查閱資料時(shí)了解到,柱層析法也可以將光合色素分離,因此進(jìn)行了用柱層析法分離光合色素的實(shí)驗(yàn),將柱層析與紙層析進(jìn)行比較;并對(duì)光合色素提取液進(jìn)行吸光度的測(cè)量,驗(yàn)證光合色素的功能,深化對(duì)光合色素種類、顏色和功能的理解。

1 實(shí)驗(yàn)原理

綠葉中的光合色素能夠溶于有機(jī)溶劑而不溶于水,因此可用無(wú)水乙醇等有機(jī)溶劑提取光合色素。在色素分離的環(huán)節(jié),因?yàn)楦鞣N色素在層析柱填充物硅膠上的吸附力不同,極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附,極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附,當(dāng)采用溶劑洗脫時(shí),發(fā)生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的過(guò)程,吸附力較強(qiáng)的組分,在層析柱中移動(dòng)的速度慢;吸附力較弱的組分,移動(dòng)的速度快,從而形成若干色帶,使各種色素相互分離。

2 材料用具

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮的菠菜葉。

2.2 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑

無(wú)水乙醇、碳酸鈣粉末、二氧化硅晶體、正己烷、氯化鈉晶體、硅膠、展開(kāi)劑[石油醚∶乙酸乙酯=6∶4(體積比)]、無(wú)水硫酸鎂。

2.3 實(shí)驗(yàn)儀器

研缽、布氏漏斗、抽濾瓶、燒杯、具塞試管、圓底燒瓶、容量瓶、比色皿、循環(huán)水泵、梨形分液漏斗、洗身球、層析柱、分光光度計(jì)等。

3 探究過(guò)程

3.1 研磨

稱取15 g新鮮菠菜葉,剪碎,放入研缽中,加入少量二氧化硅晶體、碳酸鈣粉末和20 mL無(wú)水乙醇,充分研磨,研磨物成綠色糊狀。

3.2 抽濾

準(zhǔn)備1套干凈的抽濾瓶,剪一片略小于布氏漏斗內(nèi)徑又能遮住漏斗內(nèi)所有小孔的濾紙放在布氏漏斗底部,用少量清水潤(rùn)濕濾紙,打開(kāi)循環(huán)水泵的開(kāi)關(guān),將抽濾瓶接到循環(huán)水泵上,濾紙隨即被緊緊吸在漏斗底部,立即將研磨后的混合物倒入布氏漏斗,這時(shí)可以看到綠色的濾液被吸入抽濾瓶(見(jiàn)圖1),漏斗內(nèi)的濾渣變成了淺黃綠色(見(jiàn)圖2)。濾渣抽干后,將抽濾瓶與循環(huán)水泵脫開(kāi),關(guān)閉水泵。

圖1 用布氏漏斗進(jìn)行抽濾

圖2 抽濾后的淺綠色濾渣

3.3 萃取

取1套干凈的100 mL分液漏斗,先檢驗(yàn)是否漏液。將分液漏斗放置在鐵圈上,抽濾瓶?jī)?nèi)的色素提取液倒入分液漏斗,加入約1 gNaCl固體,再加入10 mL正己烷,右手掌頂住漏斗頂端并握住漏斗,左手握住活塞處,大拇指壓緊活塞,將分液漏斗稍稍傾斜,振蕩分液漏斗,約1 min后,使漏斗上口略朝下,旋開(kāi)活塞,朝斜上方無(wú)人處放出氣體。如此振搖排氣2～3次后,將分液漏斗放在鐵圈上,靜置,直到液體分層(見(jiàn)圖3)。將下層液體從活塞口放出,上層液體從漏斗上口倒出,倒入容量瓶?jī)?nèi),待用(見(jiàn)圖4)。由于下層液體顏色偏深,色素含量仍然較大,將溶液倒入分液漏斗,加入10 mL正己烷,重復(fù)上述操作。將上層萃取液合并入容量瓶?jī)?nèi)。

圖3 用正己烷對(duì)光合色素進(jìn)行萃取

圖4 萃取得到光合色素

3.4 干燥、濃縮

加1 g無(wú)水硫酸鎂(干燥劑)子萃取液中,靜置約5 min,干燥充分后,過(guò)濾干燥劑,濾液收集到干燥的圓底燒瓶中。減壓蒸餾,至濃縮溶液約為1 mL。

3.5 填充層析柱

將層析柱下端活塞關(guān)閉,把30 g干燥的硅膠用展開(kāi)劑調(diào)成漿狀,然后倒入層析柱,打開(kāi)活塞使溶劑流出,硅膠固體下沉,用洗耳球不停敲打?qū)游鲋?使固定相填充均勻。

3.6 色素分離

調(diào)節(jié)層析柱活塞使展開(kāi)劑均勻地從下端流出,當(dāng)上端展開(kāi)劑的液面接近硅膠柱上端時(shí),將濃縮后的色素提取液倒入,層析管上端放一個(gè)裝有展開(kāi)劑的滴液漏斗,當(dāng)色譜將要完全滲入層析柱的時(shí)候,打開(kāi)滴液漏斗,并調(diào)節(jié)流速,使層析柱上端一直保持一定的液面高度(見(jiàn)圖5)。

圖5 開(kāi)始柱層析

光合色素逐漸在層析柱上發(fā)生分離,分離出不同的色帶(見(jiàn)圖6),當(dāng)色帶移動(dòng)到層析柱底部的時(shí)候,用干凈的比色皿接流出的溶液,不同的色帶流出時(shí)更換不同的比色皿。

3.7 分光光度法檢測(cè)

圓底燒瓶?jī)?nèi)剩余的少量色素濃縮液用展開(kāi)劑稀釋,然后以展開(kāi)劑為參照,在可見(jiàn)光范圍內(nèi)測(cè)量吸光度。

4 探究結(jié)果

層析柱上色帶的移動(dòng)速度及色帶的延展寬度見(jiàn)表1。

表1 光合色素的種類與移動(dòng)速度、顏色、色帶的延展寬度

收集到的各種色素溶液如圖7所示。

圖7 收集到的各種色素溶液

光合色素提取液在不同波長(zhǎng)(λ)下的吸光度(A)數(shù)值見(jiàn)表2,對(duì)應(yīng)的吸光度曲線如圖8所示。

表2 光合色素提取液在不同波長(zhǎng)下的吸光度值

圖8 光合色素提取液的吸光度曲線

5 討論分析

層析柱上色帶的數(shù)目多于紙層析法分離的結(jié)果,且顏色順序與紙層析法獲得的結(jié)果不完全相同。文獻(xiàn)顯示,除葉綠素外,葉綠體中還有許多種黃色、 橙色和紅色的色素,合稱為類胡蘿卜素,其中最多的是胡蘿卜素和葉黃素[1],由于柱層析的分離效果較好,這些色素在層析柱上進(jìn)一步分離,所以呈現(xiàn)更多的色帶。影響色素在層析柱上移動(dòng)結(jié)果的實(shí)驗(yàn)因素有很多,如研磨中加入的輔助試劑、萃取劑、展開(kāi)劑、層析柱的填充材料等,我們分析導(dǎo)致各色素在層析柱和濾紙上展開(kāi)順序有差異的主要原因是層析柱的填充材料與濾紙材料不同,對(duì)色素的吸附能力不同。當(dāng)然這仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)才能得出準(zhǔn)確結(jié)論。

從圖8中可見(jiàn),光合色素對(duì)波長(zhǎng)400～500 nm范圍內(nèi)的藍(lán)紫光和620～680 nm范圍內(nèi)的紅橙光有較強(qiáng)吸收能力,而對(duì)在波長(zhǎng)為500～600 nm范圍內(nèi)的綠光沒(méi)有吸收或吸收很弱。所以,植物最喜歡的光是紅橙光和藍(lán)紫光。

對(duì)比紙層析和柱層析分離色素,兩種分離方法各有優(yōu)勢(shì)。紙層析的方法需要的實(shí)驗(yàn)器材簡(jiǎn)便,操作簡(jiǎn)單,可以用于簡(jiǎn)單的色素分離[2]。柱層析分離操作相對(duì)復(fù)雜,但是分離的效果更好,且可以用于大量色素的提取和制備中。