中國彎頸霉多糖抗氧化和抑制氧化應(yīng)激活性研究

白明健，周 穎，程 昊，邊 聰，李名正，李 林，張春晶

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

冬蟲夏草作為一種名貴中藥，是特定真菌寄生于蝙蝠蛾幼蟲后形成的結(jié)合體[1]。冬蟲夏草具有抗氧化、增強免疫力、調(diào)節(jié)代謝等多種生物學(xué)功能[2]。天然的冬蟲夏草主要生長在高海拔地區(qū)且自然資源稀少無法滿足人們需求[3]。中國彎頸霉是天然冬蟲夏草經(jīng)過組織分離培養(yǎng)獲得的無性型品種，其藥理成分和生物活性與冬蟲夏草基本相似[4]。

關(guān)于中國彎頸霉的國內(nèi)外研究較少，早期主要集中在培養(yǎng)條件的探索和藥理成分的分析[4-5]。近年來有研究報道了中國彎頸霉提取液能夠抑制破骨細(xì)胞功能、促進成骨細(xì)胞的分化及礦化治療小鼠的骨質(zhì)疏松。此外有研究表明中國彎頸霉提取物能夠增強γ輻射后的小鼠免疫力等[6-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中國彎頸霉菌絲體能夠有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)小鼠高脂血癥的發(fā)生發(fā)展，緩解肥胖引起的慢性炎癥，降低小鼠的氧化應(yīng)激水平[8]。中國彎頸霉菌絲體多糖（Tolypocladium sinensepolysaccharide,TSP）是中國彎頸霉菌絲體的活性成分之一，目前關(guān)于其抗氧化和抑制氧化應(yīng)激能力的相關(guān)研究尚未有明確報道。

本實驗通過測定TSP 對多種自由基的清除作用來分析其體外抗氧化活性。進一步使用過氧化氫誘導(dǎo)小鼠胰島MIN6 細(xì)胞氧化應(yīng)激，通過測定氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化，探索TSP 對過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞的保護作用，為TSP 通過抗氧化和抑制氧化應(yīng)激治療疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮冬蟲夏草 2020 年6 月采集于西藏那曲市；葡萄糖 天津市大茂化學(xué)試劑廠；蛋白胨、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸鎂天津市巴斯夫化工有限公司；磷酸二氫鉀 天津市福晨化學(xué)試劑廠；維生素（Vitamin C，VC）陜西頤生堂藥業(yè)有限公司；硫酸亞鐵 天津天大化學(xué)試劑廠；水楊酸 恒興試劑；對1,1-二苯基苦基苯肼（P-1,1-diphenylpicryl phenylhydrazine，DPPH）上海麥克林生化試劑有限公司；小鼠胰島MIN6 細(xì)胞株中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；RPMI-1640 培養(yǎng)基 Hyclone；胎牛血清 Clark；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號FXP018-100）四正柏生物；鄰苯三酚、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號BC0175）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號BC0025）北京索萊寶科技有限公司；MTT 試劑盒（貨號C0009S）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒（貨號C0017）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0010）、兔抗小鼠核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2）抗體碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（phosphorylated c-jun N-terminal kinase，pJNK）抗體 英國Abcam 公司；HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）二抗、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）二抗 美國Proteintech 公司；小鼠胰島MIN6 細(xì)胞 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

Infinite E Plex 多功能全波段連續(xù)光譜檢測儀瑞士Tecan 公司；Centrifuge 5424 R 低溫高速離心機德國Eppendorf 公司；JY300E 電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；UVP Chemstudio PLUS 自動化分子成像儀 美國Analytik Jena US LLC 公司；IX73P1F 倒置顯微鏡 日本Olympus 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 中國彎頸霉菌絲體的分離和培養(yǎng) 采集新鮮冬蟲夏草，組織分離培養(yǎng)得到純種菌落，經(jīng)過形態(tài)學(xué)分析和ITS 序列比對確定為中國彎頸霉[8]。將分離培養(yǎng)獲得的菌絲體按1:100 的體積比接種到含有馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉5 g/L、硫酸鎂1 g/L、磷酸二氫鉀2.5 g/L 的液體培養(yǎng)基中，置于搖床上150 r/min，26 ℃培養(yǎng)96 h[1]。

1.2.2 中國彎頸霉菌絲體多糖的提取、純化及糖含量測定 中國彎頸霉菌絲體培養(yǎng)96 h 后離心（4000 r/min，15 min）收集菌絲體沉淀，使用熱水浸提法提取中國彎頸霉菌絲體粗多糖[9]。隨后，使用三氯乙酸法對中國彎頸霉菌絲體粗多糖進行純化得到TSP[10]，并使用苯酚-硫酸法檢測TSP 的糖含量[11]。

式中：C1表示多糖溶液帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的糖濃度；C2表示多糖溶液濃度。

1.2.3 TSP 超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基清除率測定

1.2.3.1 TSP 超氧陰離子自由基清除率測定 稱取TSP 粉末0.1 g 溶于10 mL 蒸餾水中，得到10 mg/mL的TSP 母液，精確量取0.4 mg/mL 鄰苯三酚溶液0.1 mL 和磷酸鹽緩沖液5 mL 于試管中振蕩搖勻，分別加入（5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125 mg/mL）的TSP 溶液1 mL 再加入3.9 mL蒸餾水振蕩搖勻，陽性對照使用相同濃度的VC替代TSP 溶液，空白組用蒸餾水代替TSP 溶液。使用酶標(biāo)儀測量3～30 min 內(nèi)混合溶液320 nm 處吸光度變化曲線，把各組曲線斜率帶入公式計算TSP 超氧陰離子自由基清除率[12]。

式中：K空白表示空白組吸光度曲線斜率；K樣本表示樣品組吸光度曲線斜率。

1.2.3.2 TSP 羥自由基清除率測定 在試管中依次加入6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液2 mL、不同濃度的TSP 溶液2 mL 和6 mmol/L 過氧化氫溶液2 mL 振蕩搖勻，靜置10 min 后加入6 mmol/L 水楊酸溶液2 mL 振蕩搖勻，在37 ℃水浴反應(yīng)30 min，陽性對照組用相同濃度VC替代TSP，空白組用蒸餾水代替TSP 溶液。使用酶標(biāo)儀測量510 nm 處吸光度，把各組吸光度值帶入公式計算TSP 羥自由基清除率[13]。

式中：A空白表示空白組吸光光度值；A樣品表示樣品組吸光度值。

1.2.3.3 TSP 對DPPH 自由基清除率測定 參考馮書珍等[14]的方法精確稱取DPPH 溶于無水乙醇配制成0.04 mg/mL 的DPPH 溶液。分別取不同濃度的TSP 溶液2 mL 加入DPPH 溶液2 mL 渦旋振蕩搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min 后，離心（4000 r/min，15 min），取上清液測定517 nm 處吸光度。陽性對照組用相同濃度VC替代TSP，對照組用無水乙醇代替DPPH溶液，空白組用蒸餾水代替TSP 溶液，把各組吸光度值帶入公式計算TSP 對DPPH 自由基的清除率。

式中：A空白表示空白組吸光度值；A樣品表示樣品組吸光度值，A對照表示對照組吸光度值

1.2.4 TSP 對過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞的保護作用

1.2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠胰島MIN6 細(xì)胞株具有普通胰島細(xì)胞的生理特性。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2。

1.2.4.2 TSP 給藥濃度和過氧化氫損傷濃度的選擇

稱取TSP 粉末0.05 g 溶于10 mL 培養(yǎng)基得到5 mg/mL 的含藥培養(yǎng)基，量取3%過氧化氫溶液1 mL溶于439.5 mL 培養(yǎng)基得到含2 mmol/L 過氧化氫培養(yǎng)基母液。收取處于對數(shù)生長期的MIN6 細(xì)胞，按每孔5×103個接種于96 孔板培養(yǎng)24 h，分別用含TSP 培養(yǎng)基（0～5 mg/mL）和含過氧化氫培養(yǎng)基（0～250 μmol/L）單獨處理細(xì)胞24 h，最后使用MTT試劑盒檢測生存率變化。選取對細(xì)胞生存率沒有顯著影響且對多種自由基具有較強清除作用的濃度作為TSP 給藥濃度。

1.2.4.3 實驗分組 根據(jù)MTT 結(jié)果進行實驗分組：對照組（Control），正常培養(yǎng)48 h；模型組（Model），正常培養(yǎng)24 h 后更換含200 μmol/L 過氧化氫培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；高劑量給藥組（High-TSP），正常培養(yǎng)24 h后更換含200 μmol/L 過氧化氫和0.625 mg/mL TSP培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；低劑量給藥組（Low-TSP），正常培養(yǎng)24 h 后更換含200 μmol/L 過氧化氫和0.156 mg/mL TSP 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.2.4.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將MIN6 細(xì)胞接種于6 孔板后按照1.2.4.3 的分組和處理方式培養(yǎng)48 h，在光學(xué)顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞的形態(tài)和貼壁狀態(tài)，并計數(shù)160000 μm2范圍內(nèi)懸浮細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4.5 LDH 釋放量檢測 將細(xì)胞接種于24 孔板按照1.2.4.3 的分組和處理方式培養(yǎng)48 h 收集培養(yǎng)基離心（1000 r/min，5 min）取上清液，用試劑盒進行測定。

1.2.4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡 將細(xì)胞接種于6 孔板按1.2.4.3 分組和處理方式培養(yǎng)48 h 收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書依次加入Annexin V-FITC 和碘化丙啶（propidium iodide，PI）避光孵育5 min 后利用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4.7 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)測定 將細(xì)胞接種于6 孔板按1.2.4.3 分組和處理方式培養(yǎng)48 h 收集細(xì)胞，每5×106個細(xì)胞加入1 mL 提取液，反復(fù)凍融使細(xì)胞裂解，離心（12000 r/min，15 min）收集上清，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4.8 Western Blot 檢測蛋白 將按1.2.4.3 分組和處理方式培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞收集進行蛋白提取，經(jīng)BCA 試劑盒測定蛋白濃度后，用SDS-PAGE 凝膠將其分離并轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，進行抗體孵育，并使用化學(xué)發(fā)光分析儀進行曝光。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)4 次，數(shù)值采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0 進行統(tǒng)計分析。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSP 多糖含量測定

與大多數(shù)菌類相比[9,15-16]，中國彎頸霉菌絲體多糖含量較低，使用熱水浸提法的提取率為5.27%±0.27%。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，490 nm 處吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為：y=6.376x+0.1605，R2=0.9992，說明在0～0.1 mg/mL區(qū)間內(nèi)，葡萄糖濃度與490 nm 處吸光度值具有良好的線性關(guān)系。把菌絲體多糖490 nm處吸光度值帶入方程經(jīng)過計算后得出純化前和純化后中國彎頸霉菌絲體的多糖含量分別為28.74%±1.81%和75.27%±2.09%。

2.2 TSP 體外自由基清除作用

研究發(fā)現(xiàn)TSP 對多種自由基均具有較好的清除作用且呈劑量依賴趨勢，TSP 清除超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH 自由基的IC50分別為1.16、0.55 和0.68 mg/mL（圖1A～圖1C），其中TSP 對羥自由基和DPPH 自由基清除效果要優(yōu)于超氧陰離子自由基。此外，TSP 對于多種自由基的清除作用極顯著低于VC組（P＜0.01）。李泉等[9]提取杏鮑菇多糖并測定其對DPPH 自由基清除作用的IC50為0.70 mg/mL。楊亞萍等[17]發(fā)現(xiàn)靈芝多糖清除超氧陰離子自由、羥自由基和DPPH 自由基的IC50分別為1.25、0.88 和1.04 mg/mL。上述菌類多糖對自由基的清除作用基本相似，TSP 相較于普通靈芝多糖展示出了較強的自由基清除活性。

圖1 中國彎頸霉菌絲體多糖自由基清除率Fig.1 Scavenging rate of polysaccharides from Tolypocladium sinense against radical

2.3 TSP 對過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞的保護作用

2.3.1 MIN6 細(xì)胞的生存率 不同濃度TSP（0～5 mg/mL）處理MIN6 細(xì)胞24 h 后，與對照組相比1.25～5 mg/mL 的TSP 處理使得細(xì)胞生存率極顯著降低（P＜0.01），提示TSP 濃度在較高范圍能夠抑制MIN6 細(xì)胞增殖。TSP 濃度在0.78～0.625 mg/mL 范圍內(nèi)對MIN6 細(xì)胞生存率沒有顯著影響（P＞0.05）（圖2A），結(jié)合自由基清除實驗結(jié)果在此濃度范圍內(nèi)選取對自由基具有較強清除作用且差距較大的兩個濃度作為高劑量給藥組和低劑量給藥組。因此分別選擇0.625 mg/mL 作為高劑量給藥組，0.156 mg/mL作為低劑量給藥組。

圖2 中國彎頸霉菌絲體多糖對過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞生存率的影響Fig.2 Effects of polysaccharide from Tolypocladium sinense on the survival rate of H2O2 injured MIN6 cells

不同濃度的過氧化氫（0～250 μmol/L）處理MIN6細(xì)胞24 h 后，與對照組相比較低濃度的過氧化氫促進了MIN6 細(xì)胞的增殖活性，使得MIN6 細(xì)胞的生存率出現(xiàn)極顯著增高的現(xiàn)象（P＜0.01）。隨著過氧化氫的濃度增高，MIN6 細(xì)胞的生存率逐漸降低（P＜0.05），并呈現(xiàn)出劑量依賴趨勢（圖2B）。一般選取細(xì)胞生存率75%附近的濃度作為損傷濃度最佳，故本實驗選擇200 μmol/L 過氧化氫處理MIN6 細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型。

TSP 對過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞生存率降低具有顯著的保護作用（圖2C），與對照組相比過氧化氫損傷模型組細(xì)胞生存率極顯著下降（P＜0.01），與模型組相比，高劑量組和低劑量組的細(xì)胞生存率顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。MIN6 細(xì)胞對于氧化應(yīng)激高度敏感是糖尿病發(fā)生的關(guān)鍵因素之一[18]，TSP 給藥能夠保護氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞生存率降低展示出其對于緩解氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的潛力。

2.3.2 TSP 改善過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞的生長狀態(tài)和細(xì)胞形態(tài) 細(xì)胞的正常形態(tài)是其發(fā)揮生理功能的重要保障[19]，在倒置顯微鏡下觀察MIN6 細(xì)胞的生長狀態(tài)發(fā)現(xiàn)（圖3），與對照組相比過氧化氫刺激24 h 后MIN6 細(xì)胞懸浮數(shù)量極顯著增多（P＜0.01）貼壁狀態(tài)較差（圓圈所示）、胞體變圓、絲狀偽足明顯縮短或消失（箭頭所示）表明細(xì)胞生長狀態(tài)較差。相對于過氧化氫模型組，高劑量和低劑量給藥組懸浮細(xì)胞數(shù)量極顯著減少（P＜0.01），絲狀偽足長度恢復(fù)。說明過氧化氫刺激導(dǎo)致MIN6 細(xì)胞的正常生理結(jié)構(gòu)破壞，TSP 治療能夠逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。

圖3 中國彎頸霉菌絲體多糖對過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3 Effect of polysaccharide from Tolypocladium sinense on the morphology of MIN6 cells damaged by H2O2

2.3.3 TSP 能夠減少過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放 正常情況下乳酸脫氫酶大量存在于細(xì)胞內(nèi)部，當(dāng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損后會釋放到培養(yǎng)基中，通過測定培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的水平能夠判斷細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損程度[20]。與對照組相比過氧化氫處理后的模型組乳酸脫氫酶釋放量極顯著上升（P＜0.01）提示細(xì)胞膜完整性破壞（圖4），與模型組相比TSP高低劑量給藥組乳酸脫氫酶釋放量極顯著降低（P＜0.01）。研究表明，TSP 給藥降低了培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的含量，說明TSP 能夠減輕氧化應(yīng)激對于細(xì)胞膜的損傷，增加細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。

圖4 中國彎頸霉菌絲體多糖對過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放量的影響Fig.4 Effect of polysaccharide from Tolypocladium sinense on the release of lactate dehydrogenase in MIN6 cells injured by H2O2

2.3.4 TSP 能夠降低過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞的凋亡水平 細(xì)胞凋亡是機體維持自身穩(wěn)態(tài)的重要機制，通常情況下細(xì)胞的凋亡水平能夠反映出疾病的嚴(yán)重程度[21]，如圖5 所示，過氧化氫處理組與對照組相比細(xì)胞凋亡率極顯著上升（P＜0.01），與模型組相比高劑量給藥組和低劑量給藥組細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），TSP 給藥能夠顯著降低過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平，同樣展示出其具有治療疾病的潛在藥用價值。

圖5 中國彎頸霉菌絲體多糖對過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞凋亡水平的影響Fig.5 Effect of polysaccharide from Tolypocladium sinense on the apoptosis of MIN6 cells injured by H2O2

2.3.5 TSP 降低過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平 SOD 是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶之一，主導(dǎo)多種自由基的清除過程，使細(xì)胞不受氧化損傷[22]，MDA 是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物能夠反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，其在細(xì)胞內(nèi)過量堆積會誘導(dǎo)細(xì)胞能量代謝和信號傳導(dǎo)障礙對細(xì)胞造成損傷[23]。與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)SOD 活力降低（P＜0.05），MDA 水平極顯著升高（P＜0.01），與模型組相比TSP 高劑量給藥組和低劑量給藥組細(xì)胞內(nèi)SOD 活力顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），MDA 水平顯著下降（P＜0.01）（圖6），TSP 給藥能夠通過降低細(xì)胞內(nèi)MDA 水平，增加SOD活力從而減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。

2.3.6 TSP 調(diào)節(jié)過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞中Nrf-2 和pJNK 的表達 Nrf-2 是人體抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠通過上調(diào)SOD、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等抗氧化酶的表達發(fā)揮保護細(xì)胞作用[24]。JNK 是凋亡經(jīng)典通路p38MAPK/JNK 信號通路中的關(guān)鍵分子，磷酸化是其活化方式，研究證明細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激后pJNK 的表達增高從而誘導(dǎo)了凋亡的發(fā)生[25]。過氧化氫處理模型組細(xì)胞Nrf-2表達量極顯著降低（P＜0.01），pJNK 表達量顯著升高（P＜0.05），與模型組相比高劑量給藥組細(xì)胞中Nrf-2 表達量顯著增加（P＜0.05），高低劑量給藥組pJNK表達顯著下降（P＜0.01，P＜0.05）（圖7）。結(jié)果表明過氧化氫誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，TSP 給藥能夠通過緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

圖7 中國彎頸霉菌絲多糖對過氧化損傷MIN6 細(xì)胞Nrf-2 和pJNK 表達的影響Fig.7 Effects of polysaccharide from Tolypocladium sinense on the expression of Nrf-2 and pJNK in MIN6 cells injured by H2O2

3 討論與結(jié)論

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡處于傾向氧化的狀態(tài)[26]，大量的自由基在組織和細(xì)胞中堆積，從而損傷細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[27]。研究報道了氧化應(yīng)激在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要角色[28]，其中在2 型糖尿病的胰島β細(xì)胞中這一現(xiàn)象尤為顯著[29]，因此逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激狀態(tài)治療疾病成為當(dāng)下的研究熱點[30-31]。例如在治療糖尿病的過程中，研究者通過降低患者的氧化應(yīng)激水平緩解胰島β細(xì)胞的損傷[32]。

與大多數(shù)研究相似[33-34]，本課題組初步探討了TSP 的體外抗氧化活性，自由基清除實驗結(jié)果表明：TSP 具有較好的抗氧化活性，對多種自由基均有顯著的清除作用，與VC組相比依然有顯著的差距。自由基清除實驗可以證明中國彎頸霉菌絲體中多糖是一種主要的抗氧化成分，同時也是開展后續(xù)細(xì)胞內(nèi)抑制氧化應(yīng)激實驗的基礎(chǔ)。

為了探究TSP 抑制氧化應(yīng)激損傷的分子學(xué)機制，使用200 μmol/L 的過氧化氫刺激MIN6 細(xì)胞模擬氧化應(yīng)激狀態(tài)，并給予不同劑量的TSP 保護，觀察細(xì)胞各項指標(biāo)的變化。本課題組首先探討了TSP 對過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞生存率的影響，發(fā)現(xiàn)TSP給藥能夠顯著恢復(fù)過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞生存率下降，表明TSP 能夠保護MIN6 細(xì)胞免受過氧化氫的細(xì)胞死亡。細(xì)胞生存率對于研究細(xì)胞的生長狀態(tài)具有很大的局限性，在一些情況下細(xì)胞可能并未死亡但是已經(jīng)失去了正常的生理功能。正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)是細(xì)胞發(fā)揮生理作用的基礎(chǔ)[19]，本研究發(fā)現(xiàn)過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型組細(xì)胞懸浮數(shù)量增多和絲狀偽足明顯縮短，在這種狀態(tài)下細(xì)胞的生理功能是被限制的，給予TSP 保護能夠顯著恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)，并可能恢復(fù)細(xì)胞的正常生理功能。乳酸脫氫酶是評價細(xì)胞狀態(tài)的又一個常用指標(biāo)，通過測定培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的水平能夠判斷細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損程度[20]。本研究表明過氧化氫刺激損傷了細(xì)胞膜的完整性，TSP 給藥能夠顯著降低培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶水平，增加細(xì)胞膜完整性。一些研究報道了2 型糖尿病小鼠胰島細(xì)胞凋亡水平顯著升高，給予藥物治療后能夠顯著減少胰島細(xì)胞凋亡，改善糖尿病癥狀，其部分作用可能與氧化應(yīng)激水平降低相關(guān)[35]。本研究發(fā)現(xiàn)TSP 給藥能夠顯著降低過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡升高。總而言之，本研究從多角度證明了TSP 對于過氧化氫損傷MIN6 細(xì)胞的保護作用。

在一項代謝性疾病的研究中，通過藥物治療能夠顯著緩解模型小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，主要表現(xiàn)為降低MDA 水平，提高SOD 活力[36]。SOD 作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的抗氧化酶能夠催化超氧陰離子的清除過程，從而維持細(xì)胞的氧化與抗氧化平衡狀態(tài)，MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，能夠反應(yīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平[37]。TSP 能夠顯著增加氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞內(nèi)的SOD 活力，降低細(xì)胞內(nèi)MDA 含量，這表明細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)得到緩解，氧化與抗氧化的失衡得到恢復(fù)。總之，TSP 能夠增加MIN6 細(xì)胞的抗氧化能力，減輕自由基對于細(xì)胞的損傷，其機制可能與TSP 增加了Nrf-2 的表達量相關(guān)[38]。有研究報道，三白草酮能夠通過上調(diào)HT22 細(xì)胞Nrf-2 的表達抑制過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，進而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生[39]。Nrf-2 是人體抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分能夠通過調(diào)節(jié)SOD、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶水平發(fā)揮作用[24]，由此推測TSP 的抗氧化應(yīng)激作用可能是通過上調(diào)Nrf-2 的表達水平，啟動其下游抗氧化基因的表達，增加包括SOD 在內(nèi)的抗氧化酶活性來減少氧化應(yīng)激對細(xì)胞造成的損傷。多種疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激狀態(tài)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[40]，JNK作為凋亡經(jīng)典通路p38MAPK/JNK 信號通路中的關(guān)鍵分子與氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡密切相關(guān)[41]。本研究發(fā)現(xiàn)TSP 給藥能夠顯著降低MIN6 細(xì)胞中pJNK 表達水平，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)給藥后能夠顯著減少MIN6 細(xì)胞凋亡的發(fā)生。猜測TSP 可能通過增加Nrf-2 的表達水平改善細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而降低pJNK 表達和其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但也有研究指出JNK 的磷酸化對于Nrf-2 的激活存在一定的促進作用[42]。由于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，機體多種信號通路的相互作用可能發(fā)生改變，因此TSP 在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化機制還需要進一步的深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TSP 在體外具有較好的自由基清除作用，在細(xì)胞水平的實驗發(fā)現(xiàn)TSP 可以通過增加Nrf-2 的表達來提高細(xì)胞的抗氧化能力進而減少過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生。由于本實驗只是進行了細(xì)胞水平的探索，后續(xù)需要通過構(gòu)建特殊疾病動物模型研究TSP 對動物疾病狀態(tài)下氧化應(yīng)激水平和相關(guān)蛋白表達的影響，為中藥多糖的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。