豬肉及制品中HEV、PEDV 和PDCoV 三重qPCR 方法的建立與應用

余姓鴻，張 婧，安 微，楊 苗，謝 禮，舒佳新，薛昌華，鄭 巧，林 華,，韓國全,

（1.成都海關技術中心，四川成都 610041；2.四川農業大學食品學院，四川雅安 625014）

作為豬肉生產和消費大國，我國動物源性疾病對豬肉產量和價格造成不同程度的影響，給進出口貿易帶來了巨大沖擊。2018 年以來，在非洲豬瘟、戊型肝炎等以豬為宿主的病毒感染，以及新冠疫情的沖擊下，我國2020 年第一季度豬肉產量下降29.1%，整年豬肉平均價格高達46.83 元/kg[1]，給居民豬肉消費帶來巨大壓力。其次，戊型肝炎、冠狀病毒等人獸共患病所引發的重大食源性疾病對動物源性食品安全乃至人類公共衛生安全產生了巨大威脅。2016 年，據估計，每年全世界有6 億人（幾乎每10 人中就有1 人）因食用受污染的食品而患病，并有42 萬人死亡[2]。因此，在生鮮豬肉及其制品流通環節，建立快速準確的檢測病毒方法，切斷病毒傳染源，對豬肉品質保障、動物源性疾病防控與食品安全檢測具有現實意義。

戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）和冠狀病毒（Coronaviruses，CoVs）為典型的人獸共患病病原，而豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬δ冠狀病毒（Porcine delta corona virus，PDCoV）為冠狀病毒屬，與豬的急性腹瀉密切相關。根據基因組核苷酸序列差異，HEV 可被分為八種基因型（G1～G8），其中G3 和G4 為典型的人獸共患病病原[3]。研究表明食用HEV 感染的豬肉及其制品可導致G3 和G4 傳播。西班牙一戶人家以獵殺野豬為食導致G3 戊型肝炎感染[4]；荷蘭一項研究在肝臟及其制品中均檢出HEV 核酸陽性[5]。研究顯示HEV 也存在于生血制品和用作食品添加劑的血液蛋白等其他生豬消費品中[6]。可見，食用豬肝等豬肉及制品存在HEV 感染風險。PEDV 1971 年首次出現在英國的育肥豬群中，20 世紀80 年代，豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）在日本、韓國、印度[7]、泰國[8]等亞洲多國發生大規模流行，2013 年美國發生PED 疫情，并快速傳播至14 個州[9-10]，嚴重影響全美的豬肉供應鏈。PDCoV 又稱為豬丁型冠狀病毒和豬三角洲病毒，2014 年首次在美國俄亥俄州某豬場發現[11]，隨后美國其他州的豬場同樣檢測到該病毒，迅速引起了生豬養殖行業的重視。目前該病的發病率呈逐年上升趨勢，已在美國、加拿大、墨西哥、越南、老撾、泰國、日本、韓國、中國等地均有檢出，給生豬養殖行業造成巨大經濟損失[12]。另外，研究表明PDCoV 具備跨物種傳播的能力，可造成雞、犢牛和鳥類的感染[13-14]，而豬與人類和其他野生動物接觸相對頻繁，使其極可能成為潛在的人獸共患病病毒中間宿主[15]。

HEV、PEDV 和PDCoV 均以豬作為易感宿主，三種病毒可造成豬肉及其制品病原微生物污染，人類食用被污染的肉類食品可感染相關疾病，且其繼發細菌感染存在導致人類食物中毒的風險。而HEV 和冠狀病毒（Coronaviruses，CoVs）為典型的人獸共患病病原，PEDV 和PDCoV 均為冠狀病毒屬，存在通過豬肉、豬內臟及其制品增加人類感染病毒的風險。另外，PEDV 和PDCoV 是引起豬病毒性腹瀉的主要病原，對新生仔豬危害最為嚴重，且兩種病毒在臨床癥狀、病理變化和流行病學等方面極為相似，呈混合感染[16]。自2021 年境外預檢首次檢出豬戊型肝炎后，全國海關強化國門生物安全監測機制，嚴防動物疫病輸入，加強了對國外進口生豬樣品中HEV、PEDV 和PDCoV 等動物源性食品疾病的監測[17]。目前，PCR 檢測技術在動物源性食品疫病檢測中的應用相當普遍，且對一種或兩種動物疫病病原的檢測方法已趨于穩定。有大量學者建立了HEV單重qPCR 檢測方法[18-20]，且PCR 技術在PEDV 和PDCoV 混合感染檢測應用廣泛[7,16,21-23]，但對該三種病毒的同時檢測研究較少。而目前三種病毒的單重qPCR 方法檢測耗時長，消耗試劑成本高。因此建立一種同時診斷這三種病毒的高靈敏度、快速檢測方法，為預防和阻斷HEV、PEDV 和PDCoV 的食源性傳播提供技術支撐，實現從食品原料源頭上控制和保障其食用安全，保障豬肉及其制品的消費，降低肉類進出口貿易嚴重的經濟損失，促進國際貿易發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉罐頭173 份、冷凍豬肉樣品（包括凍豬肉、罐頭原料肉、冷凍豬背膘、冷凍豬皮和豬腳等）55 份、豬肉腸，豬肉粒和豬肉片20 份 總共248 份樣品，2021 年12 月份到2022 年3 月份期間成都海關技術中心收到的送檢樣品；養殖場生豬糞拭子樣品282 份 樣本核酸均保存于成都海關技術中心實驗室-80 ℃超低溫冰箱；HEV 陽性樣本 由西南民族大學實驗室和中國疾控中心提供；非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）、豬瘟病毒（Classical swine sever virus，CSFV）、口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬圓環病毒2 型（Porcine circovirus-2，PCV-2）、豬圓環病毒3 型（Porcine circovirus-3，PCV-3）、豬細小病毒（Porcine parvovirus infection virus，PV）、豬傳染性胃腸炎病 毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、塞尼卡谷病毒（Seneca valley virus，SVV）、豬藍耳病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）陽性質?；蛞呙?由成都海關技術中心實驗室保存；QIAcuity? Probe PCR Kit、QIAcuity? One-Step Viral RT-PCR Kit、質粒小提試劑盒 QIANGEN 凱杰企業管理上海有限公司；pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體（含感受態）?；锟萍加邢薰?；SsoAdvanced Universal Probes Super mix 伯樂生命醫學產品上海有限公司；MagPure Viral DNA/RNA Mini LQ Kit 廣州美基生物科技有限公司；One Step Prime ScriptTMRTPCR Kit（Perfect Real Time）TAKARA 寶生物工程有限公司。

實時熒光定量PCR 儀、高速冷凍離心機XR3、ML 蛋白純化與核酸提取儀、恒溫混勻儀 美國賽默飛世爾科技公司；QIAcuity Four PCR 儀QIANGEN 凱杰企業管理上海有限公司；全自動凝膠圖像分析系統 美國UVP 公司；生物安全柜Biotech 公司；電子天平 德國賽多利斯公司；NanoDrop ONEC 超微量核酸蛋白儀 德國Eppendorf 艾本德中國公司；冷凍研磨儀 上海凈信實業發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物探針的設計與合成 在GenBank 中查找下載HEV 的多個候選基因序列，通過DNAMAN和Megalign 軟件進行基因序列比對，篩選出特異性片段，利用Primer 6.0 軟件設計多對引物和探針，將設計好的引物探針交予生工上海生物工程有限公司合成。PEDV 引物探針序列參照標準SN/T 1699-2017《豬流行性腹瀉檢疫技術規范》，PDCoV 引物探針序列參照標準SN/T 5124-2019《豬Delta 冠狀病毒檢疫技術規范》，序列詳細信息見表1。

1.2.2 陽性質粒制備 PEDV 和PDCoV 的陽性質粒參照各自的基因序列（GenBank 登錄號分別為MT787025.1 和OK546242.1）由生工生物公司合成。用美基公司的MagPure Viral DNA/RNA Mini LQ Kit 試劑盒提取戊型肝炎病毒核酸，擴增目的片段。反應體系參照One Step TB Green? PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）試劑盒說明書，反應程序為：逆轉錄42 ℃，5 min，95 ℃，10 s；95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環，72 ℃延伸10 min；16 ℃保存。PCR 產物經1%瓊脂糖電泳檢測，按照Takara Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 膠回收試劑盒進行切膠回收處理，隨后按照pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體（含感受態）操作說明書將目的片段連接到PUC57 載體上。最后將連接產物轉化至RTS DH5α感受態細胞，擴大培養后PCR 驗證、測序鑒定，測序結果在NCBI 上進行BLAST 分析，序列正確的即為所需陽性質粒。將制備成功的質粒用質粒小提試劑盒提取后核酸蛋白儀測定質粒濃度，計算拷貝數。凍存至-80 ℃待用。

1.2.3 病毒RNA 提取 樣品前處理參考文獻[24]。豬肉制品：用剪刀多點挑取非脂肪、非結締組織部分樣品3.0 g 置于15 mL 勻漿管中，對于調料較多的罐頭和豬肉腸樣品，先加入4 mL PBS 清洗樣品3 次，去除漂浮油脂和調味品等雜質，后加入4.5 mL PBS 顛倒混勻，用冷凍研磨儀勻漿，確保樣品組織完全破碎，反復凍融3 次，使病毒充分釋放到PBS 中，5000 r/min 離心5 min 后備用。生豬糞拭子樣品：首先，制備10%的糞便懸液，取糞便標本0.1 g 至1.5 mL EP 管中，加入0.9 mL PBS，pH 調至7.2，渦旋振蕩3 次，每次10 s。靜置10 min 后，以8000 r/min 轉速離心10 min，吸取上清至新的1.5 mL EP 管中備用。

核酸提?。何√幚砗玫臉悠飞锨逡?00 μL，按照Mag Pure Viral DNA/RNA Mini LQ Kit 提取試劑盒說明書操作，用KingFisher ML 核酸提取儀提取病毒RNA。

1.2.4 三重qPCR 方法體系建立及優化 根據One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect Real Time）試劑盒說明書進行HEV、PEDV 和PDCoV 三重qPCR 反應，反應體系和程序參照前期預實驗單重qPCR 優化好的體系和程序，程序為：預變性95 ℃，10 s；變性95 ℃，10 s,退火延伸58 ℃，30 s，45 個循環收集熒光。在此基礎上，進一步對設計的三對引物，用合成的陽性質粒進行反應程序和引物探針濃度優化。對退火溫度（52、54、56、58、60、62 ℃），引物濃度（HEV、PEDV 引物濃度10 μmol/L，PDCoV 引物濃度5 μmol/L，使用量0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 μL），探針濃度（HEV、PEDV 探針濃度10 μmol/L，使用量0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μL；PDCoV 探針濃度5 μmol/L，使用量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 μL）進行反應條件優化（見表2），再將三種病毒各自最優的引物探針濃度交叉組合后進行反應，確定三重qPCR 的最佳反應條件。

表2 HEV PEDV PDCoV 三重 qPCR 優化反應體系Table 2 HEV PEDV PDCoV triple qPCR optimization reaction system

1.2.5 三重qPCR 方法特異性試驗 提取ASFV、CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PCV3、PPV、TGEV、SVV、PRRSV 病毒核酸作為模板，加入HEV、PEDV和PDCoV 的混合陽性質粒，并以RNase Free H2O為陰性對照，使用已優化好的反應條件進行三重qPCR 反應，驗證HEV、PEDV 和PDCoV 三重qPCR方法的特異性。

1.2.6 三重qPCR 方法敏感性試驗和標準曲線繪制

將HEV、PEDV、PDCoV 陽性質粒按照體積比1:1:1 混合后，連續10 倍梯度稀釋，再2 倍稀釋，設置陰性對照，確定三重qPCR 方法最低檢測限，與標準方法[24-26]進行比對。然后選用6 個點，用Applied Biosystems? QuantStudio?5 熒光定量PCR 儀配套軟件繪制三重qPCR 方法標準曲線，并進行線性回歸分析。

1.2.7 三重qPCR 方法重復性試驗 將HEV、PEDV、PDCoV 混合陽性質粒進行連續10 倍倍比稀釋，選取106、105、104和103copies/μL 的4 個不同濃度梯度重組質粒進行三重qPCR 重復試驗，每個濃度的模板分別進行批內重復和批間重復試驗，每個濃度重復3 次，評估所建立方法的重復性。

1.2.8 人工污染豬肉樣品檢測

1.2.8.1 樣品處理方法 在2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm的小塊切割肉表面選取4 個注射點，將100 μL 104、103、102copies/μL 三個稀釋濃度的HEV、PEDV 和PDCoV 混合陽性質粒核酸提取液分別用注射器注射到三份小塊切割肉中，后放于4 ℃，2 h 以上增加病毒附著量。將污染的三個罐頭原料肉樣品分別置于3 支50 mL 離心管中，加入PBS 研磨成勻漿液，5000 r/min 離心5 min，取上清液200 μL，按照MagPure Viral DNA/RNA Mini LQ Kit 提取試劑盒說明書操作，用KingFisher ML 核酸提取儀提取病毒RNA，核酸置于-80 ℃保存。每個濃度重復3 次，同時以未污染的罐頭原料肉樣品作為陰性對照。

1.2.8.2 人工污染樣品病毒回收率計算 用建立的三重qPCR 檢測方法分別對不同濃度污染的切割肉病毒核酸和混合陽性質粒核酸進行檢測，每個濃度重復3 次，計算病毒回收率?；厥章视嬎闳缦拢?/p>

1.2.9 實際樣本檢測 對2021 年12 月份到2022年3 月份期間成都海關技術中心收到的248 份豬肉及制品和282 份各養殖場種豬糞拭子樣本核酸用三重qPCR 方法和標準檢測方法平行檢測，同時以106copies/μL 的陽性混合質粒為陽性對照，RNase Free H2O 為陰性對照。對結果進行比較分析，評價該方法的實用性。

1.3 數據處理

采用DNAMAN 和Megalign 軟件進行序列比對，Premier 6.0 進行引物設計。重復性驗證結果和回收率采用SPSS 軟件進行均數方差分析和ANOVA分析；退火溫度優化數據SPSS 軟件分析后采用Origin 繪制圖像；qPCR 圖像處理采用CFX-Managerr熒光定量PCR 儀Bio-Radcc 配套軟件和Applied Biosystems? QuantStudio?5 熒光定量PCR 儀配套軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 陽性質粒制備

HEV、PEDV 和PDCoV 三種病毒陽性質粒濃度及其拷貝數見表3。

表3 質粒濃度及拷貝數Table 3 Calculation of plasmid concentration and copy number

2.2 三重qPCR 反應體系的優化

2.2.1 退火溫度優化 HEV、PEDV 和PDCoV 三重qPCR 退火溫度優化顯示，在52～62 ℃區間設定6 個溫度梯度間Ct 值存在顯著性影響（P＜0.05）（圖1），在退火溫度58 和62 ℃時，HEV、PEDV和PDCoV 三種病毒Ct 值較小，再比較熒光信號強度，在退火溫度58 ℃時，三種病毒Ct 值較小熒光強度最高（圖2）。綜合考慮得出最優溫度58 ℃，在該退火溫度下，熒光信號強擴增曲線平滑且Ct 值較低。三重qPCR 的反應程序為：42 ℃，5 min；95 ℃，10 s；95 ℃，10 s，58 ℃，45 s，45 個循環。

圖1 不同退火溫度下三重qPCR 擴增Ct 值結果Fig.1 Results of Ct values and significance of triple qPCR amplification under different annealing temperatures

圖2 最佳退火溫度條件下三重qPCR 擴增結果Fig.2 Triple-qPCR amplification results of optimal annealing temperature

2.2.2 引物探針濃度優化 首先固定PEDV 和PDCoV 兩種病毒的引物探針濃度，根據HEV 擴增曲線Ct 值、擴增效率、熒光信號強度選出HEV 最優的兩對引物探針濃度組合（10 μmol/L，1.0 μL，1.0 μL；10 μmol/L，1.0 μL，0.8 μL），同樣方法選出PEDV 和PDCoV 最優的兩對引物探針濃度組合（PEDV：10 μmol/L，0.5 μL，0.2 μL；10 μmol/L，1.0 μL，0.5 μL，PDCoV：5 μmol/L，1.0 μL，0.5 μL；5 μmol/L，0.8 μL，0.4 μL）。再將三種病毒各自最優的兩對引物探針濃度交叉組合后進行反應，選出對三種病毒Ct 值和熒光信號強度影響最小的組合。三種病毒引物探針優化結果擴增圖見圖3，Ct 值見表4，確定三重qPCR 的最佳反應體系如表5。

圖3 HEV、PEDV 和PDCoV 三重qPCR 引物探針優化結果Fig.3 Optimization results of Triple qPCR primers and probes for HEV,PEDV,and PDCoV

表4 HEV、PEDV 和PDCoV 三重qPCR 引物探針優化結果（Ct 值）Table 4 Optimization results of triple qPCR primer probes for HEV,PEDV,and PDCoV (Ct value)

表5 HEV PEDV PDCoV 三重 qPCR 反應體系Table 5 HEV PEDV PDCoV triple qPCR reaction system

2.2.3 三重qPCR 特異性驗證 將上述已建立好的三重qPCR 檢測方法用于其他10 種相關病毒檢測，結果顯示，只有HEV、PEDV、PDCoV 有陽性擴增曲線，其余10 種病毒（ASFV、CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PCV3、PPV、TGEV、SVV、PRRSV）和陰性對照均無擴增曲線（圖4），表明建立的三重qPCR 檢測方法具有良好特異性。

圖4 HEV、PEDV 和PDCoV 三重qPCR 特異性試驗Fig.4 HEV,PEDV and PDCoV fluorescence of triple qPCR specificity test

2.2.4 三重qPCR 靈敏度和標準曲線 選用HEV、PEDV 和PDCoV 混合陽性質粒（濃度分別為6.02×107～6.02×100、6.98×107～6.98×100和6.92×107～6.92×100copies/μL）8 個梯度作為模板，使用已優化好的方法進行三重qPCR 反應，結果顯示，三種病毒濃度最低均能檢測到100copies/μL（圖5）。再將100copies/μL 混合陽性質粒梯度二倍稀釋（HEV、PEDV 和PDCoV 陽性質粒濃度分別為6.02、3.01、1.505 copies/μL，6.98、3.49、1.295 copies/μL 和6.92、3.46、1.73 copies/μL），進行三重qPCR 反應，直至無穩定曲線擴增。結果表明，三重qPCR 檢測方法中，HEV 陽性質粒檢測限為6.02 copies/μL，PEDV 陽性質粒檢測限為6.98 copies/μL，PDCoV 陽性質粒檢測限為6.92 copies/μL，低于該濃度無擴增曲線且無法收集到相關熒光信號。

圖5 HEV、PEDV 和PDCoV 三重qPCR 的靈敏度Fig.5 Sensitivity of triple-qPCR of HEV,PEDV and PDCoV

繪制標準曲線結果顯示（圖6），在核酸拷貝數107～102copies/μL 范圍內，三種病毒標準曲線均呈良好線性關系。HEV、PEDV 和PDCoV線性決定系數（R2）分別為0.999、0.996 和0.993；三種病毒引物擴增效率（E）分別為94.16%、113.56%和112.15%。

圖6 HEV、PEDV 和PDCoV 三重qPCR 標準曲線Fig.6 Standard curve of triple-qPCR of HEV,PEDV and PDCoV

2.2.5 三重qPCR 重復性驗證 以106、105、104、103copies/μL 的HEV、PEDV、PDCoV 混合陽性質粒作為模板，進行了批內重復和批間重復試驗。檢測結果各組平行數據標準差（SD）均小于0.4，集中趨勢好，組內和組間變異系數（CV%）均在0.10%～3.00%之間，可見建立的三重qPCR 檢測方法重復性以及穩定性好（表6）。

表6 HEV、PEDV 和PDCoV 三重qPCR 重復性驗證Table 6 HEV,PEDV and PDCoV triplex qPCR repeatability test

2.2.6 人工污染豬肉的檢測結果 用104、103、102copies/μL 三個濃度的HEV、PEDV 和PDCoV混合陽性質粒核酸對罐頭原料肉人工污染，評價三重qPCR 方法在食品中的檢測效果。結果顯示，HEV、PEDV 和PDCoV 三種病毒不同污染濃度的回收率滿足方差齊性（P=0.285，P=0.580，P=0.613＞0.05），選用單因素ANOVA 檢驗-LSD 法進行兩兩比較，三種病毒回收率在任意兩種污染濃度之間的差異均存在統計學意義（P＜0.05）（表7）。可見，三種病毒在不同的污染濃度的食品中回收率均較好，均能被穩定檢測。

表7 三重qPCR 方法對罐頭原料肉不同污染濃度回收率Table 7 Recovery rate of different contamination concentration of canned raw meat by triple-qPCR method

2.2.7 實際樣品檢測結果 同時用SN/T 4235-2015、SN/T 1699-2017 和SN/T 5124-2019 標準檢測方法、建立好的三重qPCR 檢測方法對2021 年12 月份到2022 年3 月份期間成都海關技術中心收到的248 份出口豬肉及其制品，以及282 份各養殖場的生豬糞拭子樣品進行檢測。檢測結果顯示，在248 份出口豬肉及其制品中，標準檢測方法、三重qPCR 方法對HEV、PEDV 和PDCoV 三種病毒的檢出率均為0%；在282 份進口的生豬糞拭子樣品中，標準方法對HEV、PEDV 和PDCoV 三種病毒的檢出率分別為0%、1.06%、3.19%；三重qPCR 方法的檢出率分別為0.35%、1.06%、3.19%（表8），可見，與標準檢測方法相比，HEV 檢出率得到了提升，PEDV 和PDCoV 檢出率一致。

表8 三重qPCR 和標準檢測方法對實際樣品的陽性檢測結果Table 8 Positive test results of triple qPCR on pig derived samples

3 討論與結論

動物源性食品中的動物疫病可以通過直接或間接污染動物源性食品，對食品安全、養殖業發展以及人類健康和公共衛生安全構成嚴重威脅。WHO 調查顯示，75%的動物疫病是人獸共患病，其中有70%至少可以傳染給一種動物[27]，像戊型肝炎病毒、諾如病毒、輪狀病毒等會造成人類食物中毒，雖然目前我國已經成功研制了戊肝疫苗，但并沒有在市面上廣泛應用，若不加強病毒傳播的防范，有可能成為我國消化道傳播的主要病毒性肝炎。而冠狀病毒中α和β屬多為人獸共患病毒，最為典型的中東呼吸綜合征病毒（MERS-CoV）和引起嚴重急性呼吸綜合征病毒（SARS-CoV）都是從動物宿主中產生的。在北京市新冠肺炎疫情防控工作第130 場新聞發布會上，國家衛生健康委專家組專家、國家食品安全風險評估中心微生物實驗室主任李鳳琴介紹，新冠病毒不會在食品之間傳播，但有可能被污染，從新冠肺炎疫情嚴重的國家進口冷鏈食品表面和外包裝都發現SARS-CoV-2 污染[28]，可見冷凍食品可能成為CoVs傳播的媒介，加重疫情形勢。另外由于冠狀病毒遺傳物質單鏈RNA 穩定性差且病毒基因組結構長，不排除其他冠狀病毒屬經變異進化感染人類的可能性。

目前，對HEV、PEDV 和PDCoV 三種病毒的檢測多采用單重熒光定量和環介導等溫擴增反應（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等基因診斷技術，多重qPCR 檢測方法的研究較少。在其他學者建立的檢測方法中，TaqMan 熒光定量RT-PCR 方法對HEV 的檢測靈敏度可達2.0×101copies/μL[19]；對PEDV 的RT-PCR 方法檢測限為4×104copies/μL[29]、實時熒光RPA 等溫檢測方法[30]和RT-LAMP 快速檢測方法[31]靈敏度均為2 copies/μL，學者對PDCoV N 基因建立熒光RTqPCR 方法檢測限為6.3 copies/μL[23]，TaqMan 探針qPCR 方法檢測極限2.2 copies/μL[32]。本研究中，三重qPCR 檢測方法對三種病毒的最低檢出限均能達到個位拷貝數，對HEV、PEDV 和PDCoV 三種病毒的最低檢測限分別為6.02、6.98、6.92 copies/μL。可見，該方法靈敏度較高，且有效規避了多重反應體系中多對引物探針的交互影響，將三種病毒相互間干擾降到最低。另外，HEV、PEDV和PDCoV 三種病毒在生豬糞拭子樣品中的檢出率與出口豬肉罐頭、罐頭原料肉、冷凍豬肉樣品等樣品相比，陽性檢出率明顯提高。國外學者對不同種類的豬肉產品進行HEV 檢測結果顯示，香腸、豬肝制品及凍豬皮等不同產品中HEV 陽性率有一定差異，在以生豬肝為原料制備的豬肝醬中HEV 陽性檢出率遠高于香腸中HEV 陽性檢出率[5,33-34]，可見豬肉經過加工成食品后，食品中病毒載量降低，且不同豬肉食品基質和熱處理、腌制等加工處理方式都會對病毒載量產生影響,這與本研究得出結論相符。而HEV 和冠狀病毒等引起胃腸炎的病毒在環境中相當穩定，在無生命表面、手和干糞便的懸浮液中均可存活[35]。因此，本研究在提高豬肉及其制品檢測效率的同時也保證了三種病毒的檢出率，對預防和阻斷HEV、PEDV 和PDCoV 三種病毒的食源性傳播具有一定參考價值。