紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料的研制及其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

袁辛銳，楊其長，王 芳，林致通,2,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所，四川成都 610065；2.四川天味食品集團股份有限公司，四川成都 610200）

羽衣甘藍是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種[1]，一種高營養(yǎng)、低熱量、高膳食纖維的蔬菜，被稱為“超級食物”[2]。其富含多種維生素和礦物質(zhì)，尤其Ca、Fe、P 含量突出[3]，含有異硫氰酸酯、多酚、類胡蘿卜素等生物活性成分，有助于抗氧化[4]、抗炎[5]、抗癌[6]。冰菜（Mesembryanthemum crystallinum）別名冰葉日中花、冰草，屬番杏科（Aizoaceae）[7]，葉面底部和莖上附著大量包含鹽類的細胞[8]，自身帶微咸味，口感清脆，富含礦物質(zhì)和維生素，黃酮類化合物含量也較高[9-10]，具有保護肝臟、抗痘、抗病毒的功效[11]。紫胡蘿卜由于富含花青素而呈現(xiàn)紫色，花青素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗氧化性較強的天然活性物質(zhì)之一，屬于多酚類化合物，具有顯著的抗氧化、抗菌、抗炎功效、改善視力[12]等功效。

目前對羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜的研究多集中在種植技術(shù)和品種鑒定上，除鮮食外，其食用價值未被充分開發(fā)利用[13]。近年來發(fā)酵果蔬飲品受到消費者的喜愛[14]，因為蔬菜水果經(jīng)發(fā)酵后，不僅營養(yǎng)吸收效率得到顯著提高[13]，同時，果蔬飲料含大量益生菌，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群[15]，維持腸道健康[16-17]。對于發(fā)酵飲料的研究也逐漸深入，比如王紫琳等[18]、王鑫等[19]分別優(yōu)化了雪蓮果、清澗紅棗發(fā)酵飲料的發(fā)酵參數(shù)，但對于蔬菜發(fā)酵飲料，尤其是以羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜的復(fù)合飲料發(fā)酵工藝鮮有研究。因此，亟需對此開展深加工技術(shù)，提升產(chǎn)品附加值。

本研究以羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜為主要原料，以安琪乳酸菌為發(fā)酵劑，制備紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料，以總糖、總酸、乳酸菌活菌數(shù)及感官評分為指標(biāo)，利用單因素實驗和正交試驗，研究了紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料的最佳工藝參數(shù)，并探討了發(fā)酵飲料的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，旨在釀造一款口感佳、營養(yǎng)豐富的發(fā)酵飲料，為蔬菜發(fā)酵飲料的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰菜、羽衣甘藍、紫胡蘿卜、白砂糖 購自超市；乳酸菌 安琪酵母股份有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、氯化鈉、葡萄糖 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；MRS 培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司。

MJ-BL1206A 破壁機、SN2105T 電磁爐 美的集團有限公司；HWS-250 恒溫培養(yǎng)箱 紹興蘇珀儀器有限公司；XHF-D-XZ 高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；TD50002A 電子天平 寧波市鄞州華豐儀器廠；SW-CJ-2FD 超凈工作臺 上海尚道儀器制造有限公司；QP2010Ultra 氣相色譜-質(zhì)譜儀（Gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料的制備

1.2.1.1 工藝流程 原料→清洗→漂燙→打漿→過濾→調(diào)配→均質(zhì)→煮沸殺菌→冷卻→接種→發(fā)酵→成品

1.2.1.2 操作要點 漂燙：將清洗干凈的羽衣甘藍進行漂燙，漂燙溫度100 ℃，時間1 min，料液比1:30（g:mL）。

打漿：將處理好的羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜分別以料液比1:2 的比例與純凈水混合后打漿。

過濾：將蔬菜漿過100 目紗布得到濾液。

調(diào)配：將羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜三種蔬菜汁以質(zhì)量比5:5:1 混合，加入蔬菜汁總質(zhì)量7%的糖并混合均勻。

均質(zhì)：常溫下用4000 r/min 均質(zhì)1 min。

殺菌：將混合液加熱，直至煮沸。

接種：待混合液冷卻到40 ℃，按7‰的比例加入發(fā)酵劑，并攪拌均勻。

發(fā)酵：在40 ℃恒溫條件下發(fā)酵36 h 后結(jié)束發(fā)酵。

1.2.2 單因素實驗 根據(jù)前期實驗結(jié)果選取糖添加量、乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間來進行單因素實驗。

1.2.2.1 糖添加量 設(shè)定糖添加量分別為4%、5%、6%、7%、8%，接種量為7‰，發(fā)酵溫度為40 ℃，發(fā)酵時間為36 h 進行發(fā)酵，研究不同糖添加量對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響。

1.2.2.2 乳酸菌接種量 設(shè)定乳酸菌接種量分別為4‰、5‰、6‰、7‰、8‰，糖添加量為7%，發(fā)酵溫度為40 ℃，發(fā)酵時間為36 h 進行發(fā)酵，研究不同乳酸菌接種量對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響。

1.2.2.3 發(fā)酵溫度 設(shè)定發(fā)酵溫度分別為38、39、40、41、42 ℃，糖添加量為7%，接種量為7‰，發(fā)酵時間為36 h 進行發(fā)酵，研究不同發(fā)酵溫度對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響。

1.2.2.4 發(fā)酵時間 設(shè)定發(fā)酵時間分別為30、32、34、36、38 h，糖添加量為7%，乳酸菌接種量為7‰，發(fā)酵溫度為40 ℃進行發(fā)酵，研究不同發(fā)酵時間對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇對實驗結(jié)果影響較大的糖添加量（A）、乳酸菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）4 個因素進行L9（34）正交優(yōu)化試驗。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels for orthogonal experiments

1.2.4 理化指標(biāo)的測定 總糖的測定：按照GB 5009.7-2016 采用滴定法，還原糖以葡萄糖計。總酸的測定：按照GB/T 12293-90 采用滴定法，總酸以乳酸計。膳食纖維的測定：按照GB 5009.88-2014《食品中膳食纖維的測定》方法測定。乳酸菌數(shù)：MRS 培養(yǎng)基平板計數(shù)法。

1.2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定 參照楊定寬等[20]的方法進行測定。

1.2.5.1 樣品的前處理 將3 mL 樣品加入頂空瓶中，于60 ℃條件下萃取55 min。

1.2.5.2 GC 條件 色譜柱：SH-Rtx-Wax 強極性毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；45 ℃保持3 min，以3 ℃/min 升溫至180 ℃，保持3 min，接著以12 ℃升溫至220 ℃，保持3 min；載氣（He）流速1.67 mL/min，壓力19.0 kPa；分流比10:1。

1.2.5.3 MS 條件 質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；溶劑延遲：3 min；增益系數(shù)：1.16；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

1.2.6 感官評價 參照葛永輝等[21]的方法制定發(fā)酵飲料的感官評分標(biāo)準，產(chǎn)品在4 ℃下貯藏24 h，請10 位專業(yè)人員根據(jù)產(chǎn)品的色澤、澄清度、香氣、滋味進行評分，滿分100 分，評分標(biāo)準見表2。

表2 紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料感官評價標(biāo)準Table 2 Sensory evaluation standards of purple carrot compound fermented beverage

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3 次，結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準偏差的表示方法。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Excel 2010 軟件進行，采用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 糖添加量對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響 糖是乳酸菌生長代謝可利用的底物，乳酸菌可通過轉(zhuǎn)化酶將糖水解為葡萄糖和果糖，從而利用這種碳源[22]。如表3 所示，隨著糖添加量的增加，總糖含量逐漸上升，膳食纖維含量無明顯差異，總酸含量先升高后趨于穩(wěn)定，活菌數(shù)和感官評分先升高后降低。發(fā)酵過程中飲料中的乳酸不斷積累使總酸含量大量增加[23]。糖添加量為4%～5%時，添加量較低，不足以為微生物生長增殖提供充足的能量，導(dǎo)致部分微生物的死亡[24-25]，從而影響了活菌數(shù)及其產(chǎn)酸能力，因此總酸含量、活菌數(shù)和感官評分均較低。糖添加量為5%～7%時，乳酸菌大量增殖，活菌數(shù)和總酸含量上升，活菌數(shù)在7%時達到最大值；糖添加量為7%～8%時，添加量過多，飲料的滲透壓增大，抑制了乳酸菌的生長和代謝，從而影響乳酸的繼續(xù)產(chǎn)生[26]。糖添加量對飲料的感官評分影響重大，添加量過低會導(dǎo)致在發(fā)酵時間內(nèi)無法形成特殊的發(fā)酵風(fēng)味，導(dǎo)致蔬菜本身的味道過重；添加量過高則會因為甜度過高，掩蓋了發(fā)酵飲料的特殊風(fēng)味；在添加量為7%時，飲料的糖酸比適宜，感官評分最高。因此，紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料的適宜糖添加量為7%。

表3 糖添加量對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響Table 3 Effects of sugar addition on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.1.2 接種量對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

如表4 所示，隨著接種量的增加，總酸、活菌數(shù)逐漸升高，總糖持續(xù)減少，感官評分先升高后降低，膳食纖維含量無明顯變化，說明膳食纖維并非由微生物發(fā)酵獲得。當(dāng)接種量為4‰時，由于乳酸菌含量較低，產(chǎn)酸量較低，飲料風(fēng)味物質(zhì)積累少，糖消耗量低、總糖含量較高導(dǎo)致整體感官偏甜且有異味，因此感官評分也較低。當(dāng)接種量為5‰～6‰時，飲料中的總酸逐漸上升，總糖含量逐漸降低，說明在一定的接種量下，總酸含量與接種量呈正相關(guān)，總糖含量與接種量呈負相關(guān)。當(dāng)接種量在7‰～8‰時，飲料的總酸上升趨勢不明顯，活菌數(shù)持續(xù)增加，但感官評分稍有降低，在接種量7‰時達到最高。這是由于乳酸菌是發(fā)酵飲料中的優(yōu)勢菌種，適宜的接種量使發(fā)酵液充分發(fā)酵[27]，同時乳酸菌能夠通過降低pH 和提高CO2水平來減少雜菌的干擾[28]，保證了飲料的良好口感；但當(dāng)接種量過大時，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，同時產(chǎn)生醇類、醛類等刺激性氣味，從而影響飲料的口感[29]。當(dāng)接種量為7‰時，酸度適中，總糖較低，活菌數(shù)較高，感官評分最高。因此，紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料的適宜接種量為7‰。

表4 乳酸菌接種量對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria inoculation amount on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.1.3 發(fā)酵溫度對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響 如表5 所示，隨著發(fā)酵溫度的增加，飲料中的膳食纖維含量變化不明顯，總酸含量和活菌數(shù)呈現(xiàn)增加趨勢，總糖含量大幅度降低，感官評分先增加后減少。發(fā)酵溫度過高或過低都會影響菌種的生長代謝。當(dāng)發(fā)酵溫度為38～39℃時，低于微生物的適宜發(fā)酵溫度時，微生物細胞內(nèi)酶活下降，影響產(chǎn)酸能力和發(fā)酵速度，不利于乳酸菌的生長，導(dǎo)致總酸含量、活菌數(shù)及感官評價較低[30-31]；當(dāng)溫度為41～42℃時，高溫會抑制菌體生長代謝甚至導(dǎo)致菌種死亡，使雜菌污染的概率升高。此外，高溫脅迫使乳酸菌發(fā)酵能力被抑制[32]，風(fēng)味物質(zhì)的積累減少，同時高溫會導(dǎo)致發(fā)酵液損失更多的芳香揮發(fā)性物質(zhì)[33]，導(dǎo)致感官評分較差。因此發(fā)酵飲料最適發(fā)酵溫度為41 ℃，在此溫度下乳酸菌活菌數(shù)較高，感官評分最高。

表5 發(fā)酵溫度對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響Table 5 Effects of fermentation temperature on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.1.4 發(fā)酵時間對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響 從表6 可看出，總糖隨著發(fā)酵時間的延長逐漸減少，總酸逐漸增加，活菌數(shù)先增加后趨于穩(wěn)定，膳食纖維含量無明顯變化，感官評分先增大后略微降低。有研究表明，在適宜接種量下，隨著發(fā)酵時間的增加，乳酸菌活菌數(shù)增加趨勢先緩慢后快速，最后趨于穩(wěn)定[34]。如表6 所示，在30～32 h 區(qū)間活菌數(shù)增加較慢，32～36 h 區(qū)間增速上升，而36～38 h 活菌數(shù)增加速度緩慢，在38 h 時活菌數(shù)最高。其原因可能是32 h 前為調(diào)整期，乳酸菌為適應(yīng)環(huán)境，主要活動為增殖，產(chǎn)酸少，風(fēng)味不佳，感官評分低；32～36 h 區(qū)間為對數(shù)期，菌體生長迅速，代謝加強，總酸含量逐步升高；36～38 h 區(qū)間為成熟期，菌體總數(shù)穩(wěn)定，一定時間內(nèi)烯烴物質(zhì)（不良風(fēng)味來源）減少，有機酸、氨基酸和各種芳香族化合物生成[35]，使得總酸和風(fēng)味物質(zhì)積累較多，但發(fā)酵時間過長不良風(fēng)味物質(zhì)積累，產(chǎn)酸過多，導(dǎo)致感官評分下降。在當(dāng)發(fā)酵時間為36 h 時，感官評分最高，飲料風(fēng)味協(xié)調(diào)，活菌數(shù)也較高。因此，飲料的最佳發(fā)酵時間為36 h。

表6 發(fā)酵時間對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響Table 6 Effects of fermentation time on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.2 正交試驗

通過單因素實驗，選擇糖添加量（A）、乳酸菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）作為考察因素，以感官評分作為評價指標(biāo)，進行4 因素3 水平的正交試驗，試驗結(jié)果及方差分析見表7 和表8。

表7 紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of purple carrot compound fermented beverage

表8 正交試驗結(jié)果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表7 極差分析結(jié)果可知，4 種因素對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料的感官評分影響的強弱順序依次為：發(fā)酵溫度＞糖添加量＞發(fā)酵時間＞乳酸菌接種量。由表8方差分析結(jié)果可知，糖添加量和發(fā)酵溫度對紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料的感官評分的影響極顯著（P＜0.01），發(fā)酵時間也對其影響顯著（P＜0.05），但乳酸菌接種量對其的影響不顯著（P＞0.05）。

實驗結(jié)果表明紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B1C3D3，即糖添加量7%，乳酸菌接種量5‰，發(fā)酵溫度41 ℃、發(fā)酵時間38 h，但正交試驗中未發(fā)現(xiàn)有此組合，對該組合進行驗證，驗證所得總糖含量0.21 g/L，總酸含量0.38 g/L，膳食纖維含量0.41 g/L，活菌數(shù)7.42×107CFU/g，感官評分最高為93.3 分。

2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成及含量分析

由表9 可知，紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料中，檢測出71 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。包括22 種醇類、16 種酮類、15 種醛類、8 種酯類、3 種酸類，以及其他化合物7 種。含量最高的是酮類化合物，為32.24%，其次是醛類化合物，為31.61%，然后是醇類化合物、酸類化合物、其他化合物及酯類化合物，其分別為16.27%、14.09%、3.36%、2.43%。

表9 紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量Table 9 Content and kinds of volatile compounds of purple carrot compound fermented beverage

酮類化合物主要有香葉基丙酮、（Z）-五癸-6-烯-2-酮、β-紫羅蘭酮等，香葉基丙酮是71 種揮發(fā)性物質(zhì)中含量最高的。酮類通常是不飽和脂肪酸氧化而成[36]，其中香葉基丙酮具有甜木蘭花香[37]，β-紫羅蘭酮具有紫羅蘭花香[38]。

醛類化合物主要有反式-2-癸烯醛、反式-2-辛烯醛、壬醛、苯甲醛等，醛類物質(zhì)通常閾值較低，較低濃度時對氣味也能起到積極促進作用[39]，通常由多酚氧化或醇類轉(zhuǎn)化而來[40]。反式-2-癸烯醛、反式-2-辛烯醛都具有脂香和清香[41]，壬醛具有柑橘、玫瑰清香[42]，苯甲醛具有果味和杏仁味[43]。

醇類化合物有里哪醇、壬醇、辛醇、柏木醇等。醇類在發(fā)酵過程中有糖代謝合成和芳香族氨基酸降解合成兩條途徑[44]。里哪醇不僅是呈香物質(zhì)，也是健康活性成分，具有清香和果香，壬醇具有強烈的玫瑰和橙子香氣，辛醇具有油脂和柑橘香味，柏木醇具有溫和的柏木芳香[45]，會使發(fā)酵飲料風(fēng)味更加復(fù)合濃郁。

酯類化合物主要有δ-十二內(nèi)酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、異硫氰酸烯丙酯等，酯類物質(zhì)通常呈現(xiàn)多種水果香味，發(fā)酵過程可以促進酯類的形成[46]。δ-十二內(nèi)酯具有桃子果香[47]，鄰苯二甲酸二異丁酯具有芳香氣味[48]，異硫氰酸烯丙酯是含介子苷類十字花科蔬菜及其加工產(chǎn)品中的獨特風(fēng)味物質(zhì)，具有一定的辛辣味和芳香味[36]。

酸類化合物包括乙酸、癸酸和壬酸。酸類主要在發(fā)酵過程中形成[49]。乙酸含量13.14%，在檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)中含量排第二位。有機酸不僅能產(chǎn)生酸味，還能提供其他香氣物質(zhì)的前體，共同構(gòu)成了發(fā)酵飲料的酸甜口感。

其他化合物包括芐腈、新植二烯、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、反式-2-（2-戊烯基）呋喃和甲氧基苯基-肟。腈類化合物是十字花科蔬菜特有的風(fēng)味物質(zhì)，帶有苦杏仁味[50]，這與何洪巨等[51]的研究結(jié)果一致。這些物質(zhì)雖然含量不高，但它們共同構(gòu)成了發(fā)酵飲料的豐富香氣。

3 結(jié)論

紫胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵參數(shù)為：糖添加量7%、乳酸菌接種量5‰、發(fā)酵溫度41 ℃、發(fā)酵時間為38 h。該條件下得到的發(fā)酵飲料酸甜適中、色澤艷麗，總糖含量0.21 g/L，總酸含量0.38 g/L，膳食纖維含量0.41 g/L，活菌數(shù)7.42×107CFU/g，感官評分93.3 分；共檢測出71 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是酮類、醛類、醇類和酸類化合物，其中，香葉基丙酮、乙酸、（E）-2-癸烯醛含量位居前三。羽衣甘藍、冰菜和紫胡蘿卜本身就具有豐富的營養(yǎng)價值和開發(fā)價值，本研究所得復(fù)合發(fā)酵飲料不僅氣味芳香，而且酸甜適口。因此，為今后蔬菜發(fā)酵飲料的開發(fā)提供新思路，同時也增加了蔬菜加工產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。但本研究未對發(fā)酵飲料的花青素、多酚等活性物質(zhì)含量以及抗氧化性展開深入探究，后續(xù)可深入研究。