桂花青脆李復合香型果酒的釀造工藝優化

陳君蕊，蘇良敏，成 欣，周睫姝，羅婧云，陳安均

（四川農業大學食品學院，四川雅安 625000）

青脆李（Prunus salicinaLindell cv.Qingcui）屬雙子葉植物綱薔薇目薔薇科（Rosaceae）李屬（PrunusL.），是我國西南地區的一種特色水果。青脆李產量大，由于其采收期天氣炎熱，導致果子呼吸旺盛，不耐貯藏，因此對其進行深加工、延長產品的生命周期，能有效避免浪費，同時也能提高產品品質[1-2]。目前青脆李加工多限于果脯蜜餞，對于青脆李果酒的相關研究相對較少，這主要是因為李酒產品往往酒體寡淡、香味不足，因而市場占有率低[3]。

桂花（Osmanthus fragransLour.）亦稱木犀、山桂、巖桂、九里香，屬木犀科（Oleaceae）木犀屬（Osmanthus），原產中國西南部，是我國十大傳統名花之一，已有2500 多年的栽培歷史，不僅極具觀賞性，還是我國傳統的花卉食品，有著悠久的食用歷史，因其具有很高的食用價值和獨特的香氣，自古以來被我國人民廣泛作為食品輔料[4-5]。

香氣成分是影響果酒品質的重要因素，也是決定消費者接受度和偏好的重要因素[6]，此前未見有學者對加花型復合果酒的香氣進行研究，也未見使用花卉與青脆李共同發酵的報道，因此本實驗添加干桂花與青脆李共同發酵，以桂花獨特的香氣豐富青脆李酒的酒體，以期為青脆李酒的加工工藝提供更高品質和更具創新性理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干桂花 四川香之源生物科技有限公司；新鮮青脆李 產自四川省阿壩藏族羌族自治州（糖度為11.2°Brix±0.1°Brix，pH 為3.57±0.02）；KD 果酒-葡萄酒專用酵母 法國馬丁威蘭特公司；食品級焦亞硫酸鉀 一諾生物科技有限公司；氫氧化鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉（四水）、硫酸銅（五水）、氯化鈉、鹽酸分析純，成都市科隆化學品有限公司；甲醇、無水乙醇、環己酮 色譜純，成都市科隆化學品有限公司；叔戊醇（標準品）色譜純，上海易恩化學技術有限公司。

SHP-350 生化恒溫培養箱 北京中興偉業儀器有限公司；一聯電子萬用爐 北京市永光明醫療儀器有限公司；CPA225D 萬分之一天平 德國Sartorius公司；7890A/59750 氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent Technologies 公司；7890B 氣相色譜儀 美國Agilent Technologies 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 青脆李酒發酵工藝 圖1 為青脆李酒的發酵工藝流程。護色殺菌：用食品級焦亞硫酸鉀將果汁的SO2濃度調整為80 mg/kg；調整糖度：用蔗糖將原果汁糖度調整為24°Brix；酵母接種：稱取0.03%KD 酵母，用5%濃度的糖水，于37 ℃條件下活化30 min；發酵過程：放置于20 ℃培養箱發酵，通過失重率判斷發酵終點（當失重率接近0 且連續2 d 失重率不變即可判斷發酵結束）；澄清：參考曾順德等[7]的方法進行澄清，稱取2.00 g 殼聚糖，加入50 mL 沸水，攪拌至完全溶解用作澄清劑，以3.0 g/L 殼聚糖用量添加澄清劑至酒中，靜置48 h 再次倒灌，分離沉淀即得到澄亮的原酒（發酵及澄清過程均用1000 mL玻璃瓶）。

圖1 發酵工藝流程Fig.1 Fermentation process

1.2.2 單因素實驗 選擇發酵溫度、桂花添加量、加花時間作為桂花青脆李酒的發酵因素，在1.2.1 青脆李酒發酵工藝的基礎上添加干桂花共同發酵，分別考察不同發酵溫度（16、18、20、22、24 ℃）、不同桂花添加量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/100 mL）及不同加花時間（發酵第0、2、4、6、8 d）條件下，所制備桂花青脆李果酒的基礎理化指標、揮發性風味物質及感官評價結果。不同發酵溫度的樣品固定桂花添加量為0.3 g/100 mL，固定加花時間為發酵第4 d；不同桂花添加量的樣品固定發酵溫度為20 ℃，固定加花時間為發酵第4 d；不同加花時間的樣品固定發酵溫度為20 ℃，固定桂花添加量為0.3 g/100 mL。

1.2.3 正交試驗 基于單因素實驗，選取發酵溫度（A）、桂花添加量（B）、加花時間（C）這3 種因素采用正交表L9（34）設計正交試驗，并以揮發性風味物質和感官評價為依據，確定最終最佳釀造工藝條件。如表1 所示。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 基礎指標檢測分析方法 酒精度采用GB 5009.225-2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中的密度瓶法進行測定[8]；干浸出物、殘糖和總酸采用GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定[9]；測定甲醇含量采用GB 5009.226-2016《食品中甲醇的測定》[10]中的方法。

1.2.5 揮發性風味物質的測定 揮發性風味物質參照XIAO 等[11]的方法，采用頂空固相微萃取（solidphase micro extraction，SPME）結合氣相色譜/質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）對桂花青脆李酒中的揮發性風味物質進行測定。色譜條件：采用30 m×0.250 mm 的HP-5MS色譜柱，初始溫度為40 ℃，保持時間1 min，以5 ℃/min 升至70 ℃，再以2 ℃/min 升至120 ℃，后以8 ℃/min 升至160 ℃，再以6 ℃/min 升至250 ℃，保持1 min，載氣為氦氣，流速為1.2 mL/min，不分流，進樣口溫度為260 ℃；質譜條件：電離方式EI，電離電壓70 eV，燈絲流量0.25 mA，連接桿溫度280 ℃，電子倍增器電壓為1500 V，掃描范圍為30～350 AMU，離子源溫度250 ℃。

1.2.6 香氣成分分析 定性、定量分析：使用NIST 14 譜庫對揮發性化合物譜圖進行比對，選取匹配度大于等于70%的物質作為有效的揮發性風味物質，并結合相關資料進行后續的分析鑒定；以環己酮為內標，采用內標法進行半定量分析。

OAV 法：參照溫華婷等[12]的方法，以氣味活度值（odor activity value，OAV）評判香氣貢獻大小。查閱揮發性成分在水中的閾值，并根據每種香氣成分的質量濃度與閾值的比值計算OAV，以此評價該香氣成分對樣品整體風味的貢獻程度[13]。一般認為，當OAV＜1 時，說明該物質對樣品總體氣味貢獻不明顯；當OAV≥1 時，說明該物質對樣品總體氣味有明顯貢獻，OAV 越大說明該物質對樣品總體氣味的貢獻程度越大[14]。OAV 按式（1）計算：

式中：Ci為香氣化合物的濃度，μg/L；OTi表示化合物在水中的嗅覺閾值，μg/L。

1.2.7 感官評價 感官評定方法采用排序法，由12 名評價員按順序評價樣品后，綜合考慮香氣、滋味、口感等，根據整體印象對樣品進行排序，根據評價員對樣品的排序計算各樣品的總排序和，然后利用Kramer 檢驗法對數據進行統計分析。

1.3 數據處理

利用IBM SPSS Statistics 26 軟件進行數據處理。采用單因素ANOVA 分析進行顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著。結果用標記字母法表示。采用Origin 2021 進行繪圖。所有實驗均重復三次。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 發酵溫度對桂花青脆李果酒品質的影響 溫度對酵母繁殖和代謝有一定的影響，它會改變微生物代謝產物的合成方向，從而影響果酒發酵[15]。由表2可知，桂花青脆李酒的酒精度隨著發酵溫度的升高呈現先升高后下降的趨勢，16～20 ℃的發酵溫度條件范圍內，各樣品間酒精度無顯著性區別（P＞0.05），在20 ℃時達到最大值，到較高溫度條件22 ℃與24 ℃時，酒精度顯著下降（P＜0.05），在24 ℃時達到最低（12.52%vol±0.02%vol）。這與鄭升海等[16]的研究結果一致，這可能是因為溫度升高使酵母菌由生長對數期過早進入穩定期，從而發酵速度變快，發酵結束的時間早，導致酒精濃度下降。殘糖隨著發酵溫度的升高而降低，在16 ℃時殘糖含量最高（4.15±0.07 g/L），而24 ℃時殘糖含量最低（3.08±0.04 g/L），這與胡康等[17]的研究結果相似。不同溫度條件下，桂花青脆李酒的總酸含量隨溫度的升高而降低，在發酵溫度為16 ℃時總酸的含量處于最高值（4.00±0.02 g/L），加花的樣品總酸含量均低于青脆李原酒（4.01±0.01 g/L）。甲醇生成量與發酵溫度成正比，在24 ℃條件下發酵的桂花青脆李酒甲醇含量最高（69.00±1.41 g/L），這與李梅等[18]關于歐李果酒中甲醇含量的研究結果相似，各溫度樣品甲醇含量均小于國家限量標準400 mg/L[19]。

表2 不同發酵溫度的基礎理化指標測定結果Table 2 Identifification of basic physicochemical indexes in different fermentation temperatures

由圖2 可見，揮發性風味物質的總量隨著溫度的升高呈現先升高后下降的趨勢，其中在18 ℃條件下發酵的桂花青脆李酒的物質總量、醇類物質、酮類物質、其他物質的含量皆為最高，說明在18 ℃條件下發酵時，桂花的加入能最大程度上優化青脆李酒的揮發性風味物質含量，16 ℃次之，20 ℃與CK（青脆李原酒）之間在物質總量上無顯著性差異（P＞0.05）。由圖3 可知，18 ℃及20 ℃條件下發酵的桂花青脆李酒的物質總數最多，16 ℃次之。

圖2 不同發酵溫度條件下各類揮發性風味物質的總量Fig.2 Total amount of various volatile flavor compounds in different fermentation temperatures

圖3 不同發酵溫度條件下揮發性風味物質的數量Fig.3 Quantity of volatile flavor compounds in different fermentation temperature

12 名評價人員品評了不同溫度條件下發酵的桂花青脆李酒及CK 酒樣，對6 組樣品的整體風味進行了接受程度的排序，排序結果結果見表3。參考汪浩明[20]的排序檢驗法，得出評員數J=12，每組樣品數P=6 時的臨界值，見表4。

表3 不同發酵溫度感官排序結果Table 3 Sensory ranking of different fermentation temperature

表4 J=12，P=6 時臨界值表Table 4 Critical values when J=12,P=6

先通過上段臨界值來檢驗樣品間是否有顯著差異，把每個樣品的秩次和同上段最大值Rimax和最小值 Rimin相比較，一組樣品中若存在某個排序和≥最大值Rimax或者≤最小值Rimin，即為在對應顯著水平存在顯著性差異，否則沒有顯著差異。由表3 對應表4 上段臨界值（25～59）可知，R18℃=20＜R16℃=24＜Rimin=28，Rimin=28＜R20℃=36＜R22℃=47＜R24℃=55＜Rimax=59，Rimax=59＜RCK=68，所以這6 個樣品可以分為三組：16℃、18 ℃為一組，20 ℃、22 ℃、24 ℃為一組，CK 為一組。

因此，在1%的顯著水平，16、18 ℃樣品感官質量最佳，20、22、24 ℃處在同一水平且在感官質量上無顯著性差異，CK 感官質量最差。

綜合揮發性風味物質和感官排序結果，選擇16、18、20 ℃進行后續正交試驗。

2.1.2 桂花添加量對桂花青脆李果酒品質的影響由表5 可知，添加桂花后，酒精度隨著添加量的增加沒有呈現明顯的變化趨勢。在不同添加量的共發酵型青脆李酒樣中，干浸出物含量隨著桂花添加量的增加呈增加趨勢，添加0.5 g/100 mL 桂花的樣品干浸出物含量最高（30.20±0 g/L）。殘糖含量隨著添加量的增加呈上升趨勢，添加0.1 g/100 mL 桂花的樣品殘糖含量最低（3.17±0.07 g/L），而0.5 g/100 mL 添加量的樣品殘糖含量最高（3.81±0.02 g/L）。總酸含量與桂花添加量呈反比，隨著添加量的增加，總酸含量不斷減少，0.1、0.2 g/100 mL 桂花添加量的樣品總酸含量最高（4.00±0.02 g/L），0.5 g/100 mL 添加量的樣品總酸含量最低（3.64±0 g/L）。甲醇含量隨著添加量的增加而不斷升高，但是含量均小于國家限量標準400 mg/L。

表5 不同桂花添加量的理化指標測定結果Table 5 Identifification of basic physicochemical indexes in different additions of Osmanthus

由圖4 可知，添加桂花發酵之后，酯類物質的含量相較青脆李原酒明顯下降，醇類物質、醛類物質及其他物質均增加，物質總量除了0.1 g/100 mL 以外都較原酒有所增加，其中，在沒有添加桂花的青脆李原酒中未檢出酮類物質，這說明桂花青脆李酒中的酮類物質主要由桂花提供。由圖5 可知，添加0.2、0.3、0.4、0.5 g/100 mL 桂花發酵的酒樣揮發性風味物質總數均高于青脆李原酒。

圖4 不同桂花添加量的各類揮發性風味物質的總量Fig.4 Total amount of various volatile flavor compounds in different additions of Osmanthus

圖5 不同桂花添加量的揮發性風味物質的數量Fig.5 Quantity of volatile flavor compounds in different additions of Osmanthus

由表6 結合表4 上段臨界值（25～59）可知，R0.4=22＜Rimin=25，Rimax=59＜RCK=71，說明在1%顯著水平，CK 及不同桂花添加量的樣品之間存在顯著性差異。接著通過表3 的排序秩和對應表4 下段臨界值（28～56）可以檢查樣品間差異程度，若秩次和在下段范圍內，則可將其劃為一組，該組內的樣品間無顯著差異，如果秩次和在下段范圍的上限之外和在下限之外的樣品可分別組成一組。表3 和表4 下段可知，R0.4=22＜R0.5=23＜Rimin=28，Rimin=25＜R0.3=34＜R0.2=47＜R0.1=55＜Rimax=56，Rimax=56＜RCK=71，所以這6 個樣品可以分為三組：0.4、0.5 g/100 mL 為一組，0.2、0.3、0.1 g/100 mL 為一組，CK 為一組。在1%的顯著水平，0.4、0.5 g/100 mL 添加量的樣品感官質量最佳，0.2、0.3、0.1 g/100 mL 次之，CK 感官品質最差，組間均無顯著性差異。

表6 不同桂花添加量感官排序結果Table 6 Sensory ranking of different additions of Osmanthus

綜合揮發性風味物質和感官排序結果，選擇0.3、0.4、0.5 g/100 mL 添加量進行后續正交試驗。

2.1.3 加花時間對桂花青脆李果酒品質的影響 由表7 可見，加花時間越早，即桂花參與發酵過程的時間越長，酒精度越低，在發酵第0 d 添加桂花發酵的樣品酒精度最低（11.58%vol±0.01%vol），而發酵第8 d 加花的樣品酒精度最高（13.03%vol±0.04%vol），不同加花時間的桂花青脆李酒樣品的酒精度均低于原酒（13.19%vol±0.01%vol），結合表5 中不同桂花添加量對桂花青脆李酒酒精度的影響結果，可知桂花的加入對于青脆李酒的酒精度有明顯影響，桂花參與的程度越深，酒精度越低。不同的加花時間對于干浸出物的影響不顯著（P＞0.05），在發酵第8 d 加花的樣品干浸出物含量略低（28.90±0 g/L），加花的酒樣干浸出物含量均高于青脆李原酒（27.90±0 g/L）。殘糖的含量均隨著桂花參與時間的延后而下降，發酵第0 d的殘糖含量最高（3.59±0.07 g/L），發酵第8 d 的殘糖含量最低（3.24±0.04 g/L）。總酸隨著桂花參與度的降低而增加，加花時間越靠后，總酸的含量越高。甲醇的含量無顯著性變化且均小于國家限量標準。

表7 加花時間對基礎理化指標的影響Table 7 Identifification of basic physicochemical indexes in different time to add Osmanthus

由圖6 和圖7 可知，在不同時間添加桂花參與青脆李酒的發酵過程對于最終揮發性風味物質含量和數量的形成有明顯的影響作用，其中在第6 d 添加桂花發酵而成的酒樣揮發性風味物質的總量最少，比原酒還要少。在發酵第0 d 添加桂花在最大程度上參與了發酵過程，最終呈現的香氣物質總量及總數（28）都顯著優于其他樣品（P＜0.05），發酵第2 d 添加桂花也在很大程度上參與了發酵，其結果僅次于發酵第0 d 加花的樣品，而發酵第4 d 正好是發酵開始旺盛的時候，在此時添加桂花也能明顯增加青脆李酒的品質，第6 d開始酒樣失重比較大，這時添加的桂花香氣流失比較嚴重。而到第8 d 發酵趨于平靜階段，雖然時間較晚，此時添加桂花參與發酵進程的時間較短，但是結果仍然在含量上優于第6 d 加花的酒樣。

圖6 不同加花時間的各類揮發性風味物質的總量Fig.6 Total amount of various volatile flavor compounds in different time to add Osmanthus

圖7 不同加花時間的揮發性風味物質的數量Fig.7 Quantity of volatile flavor compounds in different time to add Osmanthus

根據表8 對應表4 上段臨界值（25～59）可知，R第0d=24＜R第2d=25≤Rimin=25，Rimax=59＜RCK=70，說明在1%顯著水平，CK 及不同溫度發酵的樣品之間存在顯著性差異。接著對應表8 及表4 下段臨界值（28～56）檢查樣品間差異程度，對樣品進行分組，R第0d=24＜R第2d=25≤Rimin=28，Rimin=28＜R第4d=33＜R第8d=48＜R第6d=52＜Rimax=56，Rimax=56＜RCK=70，因此這6 個樣品可以分為三組：發酵第0 d，第2 d 加花為一組，第4 d，第6 d，第8 d 為一組，CK 為一組，組間無顯著性差異。

表8 不同加花時間的感官排序結果Table 8 Sensory ranking of different time to add Osmanthus

因此，在1%的顯著水平，發酵第0 d，第2 d 加花的樣品感官質量最佳；第4 d，第6 d，第8 d 次之且處于同一水平；CK 感官質量最差。

綜合揮發性風味物質和感官排序結果，選擇發酵第0 d、第2 d 和第4 d 加花作為進行后續正試實驗的加花時間。

2.2 正交試驗結果

根據單因素實驗結果，以發酵溫度、桂花添加量、加花時間為影響因素，以揮發性風味物質和感官評價為主要評價指標，采用L9（34）正交試驗設計對桂花青脆李復合果酒發酵工藝進行優化。正交試驗設計方案見表9。

表9 正交試驗設計及結果Table 9 Orthogonal experimental design and results

由表10 可知，正交試驗9 組樣品共鑒定出39 種香氣物質，包括15 種酯類、8 種醇類、4 種酮類、3 種醛類、9 種其他類，其中芳樟醇、二氫-β-紫羅蘭醇、酮類物質中的二氫-β-紫羅蘭酮和β-紫羅酮以及其他類中的茶香螺烷等都是桂花中特有的物質[21]。

表10 正交試驗香氣質量濃度檢測結果Table 10 GC-MS analysis of volatile aroma components in results of orthogonal experimental design

根據表11 正交試驗香氣質量濃度檢測結果數據再對應閾值可得到各物質的氣味活度值（OAV），OAV 可作為評價揮發性香氣成分在食品基質中貢獻大小的更精準的標準[34]。本文中閾值參考里奧·范海默特[23]，同時參考文獻中報道的化合物香氣閾值。OAV 分析結果如表11 所示。對各樣品氣味活度值的總和進行極差分析，以此作為正交試驗結果分析的主要依據（表12）。

表11 正交試驗結果香氣的OAV 值Table 11 OAV values of volatile aroma components in results of orthogonal experimental design

表12 正交試驗結果分析Table 12 Analysis of orthogonal experimental results

由正交試驗分析可知對于氣味活度值的影響程度，桂花青脆李果酒發酵各因素之間主次順序為：桂花添加量＞加花時間＞發酵溫度，最優的發酵條件為：發酵溫度18 ℃，添加量0.5 g/100 mL，加花時間第0 d，與序號6 的條件一致。因此從正交試驗分析結果來看，序號6 的樣品香氣貢獻最佳。但是果酒對于香氣的貢獻除了來源于香氣化合物自身閾上濃度貢獻外，還可能存在閾下濃度的協同增效作用，因此要結合感官結果綜合評價。

由表13 結合表14 上段顯著性水平在5%的（α=5%）臨界值（38～82）可知，Rimin=38＜R6=39＜R3=43＜R2=48＜R1=53＜R5=58＜R7=R8=77＜R9=79＜Rimax=82，所以這9 個樣品不存在顯著性差異，但是編號2、3、6 的樣品相對更受歡迎，其中樣品6 的排序秩次和最小（R6=39）。

表14 J=12，P=9 時臨界值表Table 14 Critical values when J=12,P=9

綜合正交試驗樣品的香氣貢獻總量分析結果（序號6 的樣品香氣貢獻總量最高，為47470.04 μg/L）及感官排序結果，可以確定樣品6 為最佳發酵工藝條件，工藝參數為：發酵溫度18 ℃，添加量0.5 g/100 mL，加花時間第0 d。

3 結論

由單因素實驗結果可知，桂花的添加對于青脆李酒揮發性風味物質有明顯的影響：當固定添加量為0.3 g/100 mL，加花時間為發酵第4 d 時，物質總數均高于原酒，在物質的總量上，只有較低溫度條件發酵的樣品（16、18 ℃）顯著高于青脆李原酒（P＜0.05），20 ℃的樣品物質總量于原酒無顯著性差別；在20 ℃溫度條件下，于發酵第4 d 加花時，桂花添加量不低于0.3 g/100 mL 的樣品揮發性風味物質的含量及種類均顯著高于青脆李原酒；當固定添加量為0.3 g/100 mL，于20 ℃溫度條件下發酵時，發酵第0 d、第2 d 加花的樣品揮發性風味物質的含量顯著高于原酒，加花的各樣品物質數量均高于未加花的原酒，數量隨著參與時間的延后而減少。根據感官排序結果，所有加花的樣品均顯著優于原酒，說明添加桂花對于青脆李酒感官品質的改善是頗具價值的。

通過正交試驗結合各樣品OAV 貢獻總量，得到最優組合（發酵溫度18 ℃，添加量0.5 g/100 mL，加花時間第0 d），再對應感官排序結果可知該組合條件下感官品質也最優，且正好為正交設計中序號6 的樣品。工藝條件的確定從加花增香型復合果酒的角度出發，為提高青脆李酒產品品質提供了新的理論依據。