濕法糖基化改性大豆分離蛋白在低致敏千頁(yè)豆腐中的應(yīng)用

欒慧琳，華曉晗，戴澍涵，賈 鑫，殷麗君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）由低溫脫脂豆粕加工而成，蛋白質(zhì)含量在90%以上，其中7S 和11S 蛋白約占70%，而這兩種蛋白也是大豆中最主要的致敏蛋白[1-2]。SPI 因營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、功能特性好，在食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。千頁(yè)豆腐就是以SPI 為主要原料的一種低脂、低碳水化合物但富含蛋白質(zhì)的大豆制品，其口感細(xì)膩、軟彈、吸汁性好，而且沒(méi)有傳統(tǒng)豆腐的豆腥味，具有廣闊的市場(chǎng)前景[3-4]。近年來(lái)，隨著大豆制品銷(xiāo)量的增加，大豆過(guò)敏的發(fā)病率也逐年上升，大豆蛋白過(guò)敏這一食品安全問(wèn)題也不容忽視[5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大豆過(guò)敏患者約占食物過(guò)敏總?cè)藬?shù)的25%，而目前治療過(guò)敏的最有效方法仍是遠(yuǎn)離過(guò)敏原[6]。因此，降低食物致敏性已成為研究熱點(diǎn)。已有研究通過(guò)熱處理[7]、酶水解[8]、發(fā)酵、基因修飾、栽培育種[9]和糖基化[5]等方法消除大豆蛋白過(guò)敏原。其中，糖基化改性被認(rèn)為是一種有前景的降低食物蛋白致敏性的方法[10]。

糖基化反應(yīng)是美拉德反應(yīng)的前期階段，蛋白質(zhì)中氨基酸側(cè)鏈的ε-氨基與碳水化合物的羰基共價(jià)連接而形成糖蛋白[11]。糖基化反應(yīng)受多種因素影響，通過(guò)控制反應(yīng)條件，可以使糖基化反應(yīng)生成特定產(chǎn)物，掩蓋食物的過(guò)敏原表位，從而降低食物致敏性，還可改善蛋白質(zhì)的功能特性[12]。已有研究通過(guò)糖基化改性，來(lái)改善蛋白質(zhì)的乳化性、溶解性、凝膠性[13-15]。還有研究通過(guò)糖基化反應(yīng)制備大豆分離蛋白-乳糖復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)β-伴大豆球蛋白的抗原性降低了50%以上[16]。在花生7S 球蛋白的糖基化修飾中，也發(fā)現(xiàn)了降低致敏的作用[17]，但也有研究發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物會(huì)激發(fā)更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[18]。傅玲琳等[19]通過(guò)多酚-大豆蛋白共價(jià)復(fù)合物溶液與低聚還原糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)制備低致敏大豆蛋白粉，在降低大豆蛋白致敏性的同時(shí)也減少了其中的糖基化終末產(chǎn)物。糖基化改性蛋白在肉丸、蛋糕等產(chǎn)品中也有應(yīng)用，并且有良好的效果[20]。蛋白質(zhì)糖基化改性的研究還有很多，但大部分研究所用糖的種類(lèi)比較單一，而且在降低蛋白致敏性方面的研究仍存在爭(zhēng)議。此外，糖基化反應(yīng)產(chǎn)物在食品中的應(yīng)用較少，作為主要原料應(yīng)用于低致敏豆制品的研究更是未見(jiàn)報(bào)道，經(jīng)糖基化改性后的SPI 能否具有良好功能特性尚待探究。

本文以葡萄糖、木糖兩種小分子糖為糖基供體，對(duì)SPI 進(jìn)行濕法糖基化改性，探究綠色、高效的糖基化改性條件，研究糖基化改性程度與SPI 致敏性的聯(lián)系，實(shí)現(xiàn)其在低致敏千頁(yè)豆腐中的應(yīng)用，對(duì)于降低SPI 的致敏性，減少過(guò)敏的發(fā)生，保障食品安全，推動(dòng)SPI 廣泛應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-無(wú)水葡萄糖（分析純）、D-木糖（分析純）、β-巰基乙醇（分析純）、冰乙酸（分析純）、甲醇（分析純）、溴化鉀（光譜純）上海麥克林生化科技有限公司；大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)≥85%）、鄰苯二甲醛（OPA）、四硼酸鈉（分析純）、20% SDS 溶液、考馬斯亮藍(lán)R250（染料含量＞65%）、Precast-Gel 變性蛋白預(yù)制膠（濃度4%～15%）、彩虹245 plus 光譜蛋白Marker（5～245 kDa）、2×蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑）、Bradford 蛋白定量試劑盒、TBST 緩沖液、牛血清白蛋白（BSA ≥98%）、單組分TMB 顯色液、TG 酶-大豆分離蛋白（100 U/g ）北京索萊寶科技有限公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗人IgE Sigma 公司。

THZ-82A 水浴恒溫振蕩器 常州榮華儀器制造有限公司；TGL-185M 高速離心機(jī) 平凡儀器儀表有限公司；LGJ-18A 冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)福瑞科儀有限公司；UVmini-1240 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津公司；SPECTRUM 100 傅里葉變換紅外光譜儀 PkinElmer；CT3 物性分析儀 阿美特克-博勒飛公司；DYY-6C 電泳儀 北京市六一儀器廠；Model 550 酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SPI 糖基化產(chǎn)物的制備

1.2.1.1 SPI 溶液制備 稱(chēng)取一定量SPI 溶解于蒸餾水中，在常溫下，磁力攪拌2 h 至充分溶解，離心（2500×g）30 min，取上清液，存放于4 ℃。

1.2.1.2 糖基化產(chǎn)物制備 反應(yīng)溫度對(duì)糖基化反應(yīng)的影響：向25 mg/mL SPI 溶液中加入等比例葡萄糖或木糖，攪拌至充分溶解，調(diào)pH 至8.0，裝入離心管中，密封，分別在60、75、90 ℃溫度下水浴振蕩反應(yīng)3 h，取出，迅速冰浴15 min，存放于4 ℃。

反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖基化反應(yīng)的影響：向25 mg/mL SPI 溶液中加入等比例葡萄糖或木糖，攪拌至充分溶解，調(diào)pH 至8.0，裝入離心管中，密封，分別在90 ℃下水浴振蕩反應(yīng)0、0.5、1、2、3、4、5、6 h，取出，迅速冰浴15 min，存放于4 ℃。

蛋白濃度對(duì)糖基化反應(yīng)的影響：調(diào)整SPI 溶液蛋白濃度為7.5、15、25、35 mg/mL，分別加入等比例葡萄糖或木糖，攪拌至充分溶解，調(diào)pH 至8.0，裝入離心管中，密封，在90 ℃下水浴振蕩反應(yīng)3 h，取出，迅速冰浴15 min，存放于4 ℃。

蛋白與糖比例對(duì)糖基化反應(yīng)的影響：向25 mg/mL SPI 溶液中按蛋白與糖質(zhì)量比3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 分別加入葡萄糖或木糖，攪拌至充分溶解，調(diào)pH 至8.0，裝入離心管中，密封，在90 ℃溫度下水浴振蕩反應(yīng)3 h，取出，迅速冰浴15 min，存放于4 ℃。

1.2.1.3 糖基化改性大豆分離蛋白樣品制備 將糖基化反應(yīng)后的蛋白溶液pH 調(diào)至4.5，靜置30 min 后離心（1000 r/min）5 min，將沉淀復(fù)溶至40 mg/mL，用NaOH 調(diào)pH 至7.0，置于冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，用瑪瑙研缽磨成細(xì)粉，保存于干燥器中，得到糖基化改性大豆分離蛋白樣品。

1.2.2 糖基化產(chǎn)物接枝度測(cè)定 參考文獻(xiàn)[10]的OPA 法測(cè)定自由氨基含量并計(jì)算糖基化產(chǎn)物的接枝度。

1.2.2.1 試劑配制 試劑1：稱(chēng)取40 mg OPA 于棕色試劑瓶中，加入1 mL 甲醇溶解，再加入3 mL 蒸餾水，混勻備用；試劑2：向50 mL 棕色容量瓶中，加入2.5 mL 20%（W/W）SDS 溶液，25 mL 0.1 mol/L 硼砂，100 μLβ-巰基乙醇，用蒸餾水定容后備用。兩種試劑均現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2.2 接枝度測(cè)定及計(jì)算 取0.3 mL 試劑1、3.7 mL 試劑2 于10 mL 離心管中，加入200 μL 樣品液，并以200 μL 蒸餾水為空白對(duì)照，混勻后于35 ℃反應(yīng)2 min，測(cè)定其在340 nm 的吸光值A(chǔ)（340 nm）。

式中：A1：未糖基化SPI 在340 nm 的吸光值；A2：糖基化后樣品在340 nm 的吸光值。

1.2.3 糖基化產(chǎn)物褐變程度測(cè)定 參考文獻(xiàn)[10]的方法，分別取2 mL 相同蛋白濃度的樣品液于離心管中，各加入里面1 mL 20%（W/W）SDS 溶液，1 mL0.1 mol/L 硼砂溶液，混勻后，測(cè)定其在420 nm 的吸光值A(chǔ)（420 nm）。

1.2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳 用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整各蛋白樣品溶液濃度為2 mg/mL。將蛋白樣品溶液與2×蛋白上樣緩沖液1:1 混合，沸水浴5 min 后離心。按電泳預(yù)制膠要求進(jìn)行電泳，加樣5 μL。當(dāng)彩虹Marker 譜帶全部顯現(xiàn)時(shí)，停止電泳。分離電泳膠，搖床振蕩染色20 min 后，用脫色液漂洗至凝膠底色接近無(wú)色。

1.2.5 傅里葉紅外光譜分析 將溴化鉀在105 ℃烘箱中烘干3 h，稱(chēng)取200 mg 溴化鉀于瑪瑙研缽中，在紅外燈下研磨均勻，加入2 mg 樣品研磨均勻，將研磨好的樣品倒入模具中，上下振動(dòng)鋪平，在壓片機(jī)上壓片，升壓至壓25～30 MPa，停留1 min，取出壓成透明的薄片，用Spectum 進(jìn)行4000～400 cm-1全波段掃描，掃描32 次。以200 mg 溴化鉀薄片為背景。

1.2.6 致敏性測(cè)定

1.2.6.1 ELISA 相關(guān)溶液配制 包被液（pH9.6 的CBS 溶液）：稱(chēng)取0.7950 g 碳酸鈉、1.4650 g 碳酸氫鈉，溶解后，定容至500 mL，存放于4 ℃；封閉液（1%BSA）：稱(chēng)取0.2 g BSA，加入20 mL TBST，存放于4 ℃；一抗：人血清用1% BSA 稀釋10 倍；二抗：山羊抗人IgE-HRP 酶標(biāo)記物用1% BSA 稀釋2000 倍。

參考文獻(xiàn)[21]的間接ELISA 法將蛋白樣品稀釋至5 μg/mL，包被96 孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，每個(gè)樣品做三次平行，用封板膜封好，4 ℃過(guò)夜。次日傾去孔內(nèi)液體，拍干，用TBST 洗滌3 次，每孔100 μL，每次1 min。拍干后，每孔加入150 μL封閉液進(jìn)行封閉，37 ℃孵育2 h，TBST 洗滌3 次，拍干；每孔加入100 μL 一定稀釋度的一抗血清（人抗大豆蛋白血清），37 ℃孵育2 h，TBST 洗滌3 次，拍干；每孔加入100 μL 一定稀釋度的二抗（山羊抗人HRP-IgE），37 ℃孵育1 h，TBST 洗滌6 次，拍干；每孔加入100 μL TMB，37℃避光反應(yīng)15 min，取出后迅速加入50 μL 1 mol/L 硫酸，終止反應(yīng)，在30 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm 處的OD 值。以未改性SPI 為對(duì)照。

式中：OD樣：樣品真實(shí)的OD 值；OD測(cè)：測(cè)得的樣品OD 值；OD白：空白孔的OD 值；OD0：對(duì)照組樣品的真實(shí)OD 值；OD1：實(shí)驗(yàn)組樣品的真實(shí)OD 值。

1.2.7 千頁(yè)豆腐制備 稱(chēng)取7.5 g SPI 加入40 g 蒸餾水，攪打5 min，至表面光滑，無(wú)明顯顆粒，再加入0.75 g TG 酶，攪拌4 min，混合均勻后，加入7.5 g 大豆油，快速攪拌3 min，至充分乳化，顏色發(fā)白，加入2.5 g 玉米淀粉，攪拌2 min，至均勻細(xì)膩，將其倒入平皿中，抹平，蓋上保鮮膜，于45 ℃放置1 h，定型。取出放于95 ℃，5 min，進(jìn)行滅酶處理。

1.2.8 千頁(yè)豆腐質(zhì)構(gòu)測(cè)定 選用直徑10 mm 的圓柱探頭（TA 10），進(jìn)行TPA 測(cè)定。將豆腐切成半徑為2 cm、高度為1 cm 的四分之一圓柱形，測(cè)試速度1.00 mm/s，模式為50%壓縮比，壓力為5.0 g，重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)量3 次，所得數(shù)據(jù)用SPSS 21軟件計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行方差分析，P＜0.05 表示差異顯著，用 Origin 2018 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化反應(yīng)接枝度分析

研究表明，SPI 與糖的糖基化反應(yīng)會(huì)使蛋白質(zhì)分子中的自由氨基和糖分子的羰基發(fā)生共價(jià)連接，因此，通過(guò)OPA 法測(cè)定反應(yīng)體系中大豆蛋白自由氨基的變化可反映出SPI 糖基化反應(yīng)的程度[22]。

對(duì)不同反應(yīng)條件下糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)各個(gè)反應(yīng)條件下木糖都比葡萄糖更容易與SPI 發(fā)生糖基化反應(yīng)，且反應(yīng)速度更快。由此看來(lái)，分子量更小的五碳醛糖比六碳醛糖更易發(fā)生糖基化反應(yīng)[23]。王魯慧等[15]也發(fā)現(xiàn)分子量更小的葡萄糖比麥芽糖更易與SPI 發(fā)生美拉德反應(yīng)。

反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)SPI-葡萄糖、SPI-木糖糖基化反應(yīng)程度影響的變化規(guī)律是一致的，糖基化反應(yīng)程度隨反應(yīng)溫度的升高和反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯提高（P＜0.05），并且木糖反應(yīng)體系的糖基化反應(yīng)程度較葡萄糖反應(yīng)體系更高。由圖1a 可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，SPI-葡萄糖糖基化反應(yīng)程度很低，糖基化反應(yīng)幾乎不能進(jìn)行，說(shuō)明此時(shí)的溫度所提供的能量不足以使SPI-葡萄糖、SPI-木糖糖基化反應(yīng)發(fā)生。當(dāng)體系溫度達(dá)到75 ℃，反應(yīng)程度有所提高，當(dāng)反應(yīng)體系達(dá)到90 ℃時(shí)，反應(yīng)程度顯著提高（P＜0.05）。由圖1b可知，反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖基化反應(yīng)程度有很大影響，SPI 與葡萄糖在加熱2 h 后糖基化反應(yīng)程度才有明顯提升，而SPI 與木糖發(fā)生糖基化反應(yīng)所需能量較低，因此，糖基化反應(yīng)程度從開(kāi)始就在穩(wěn)步提升。

從圖1c 可以看出，糖基化反應(yīng)的接枝度（DG）隨著蛋白濃度的增加，表現(xiàn)出先增加后基本不變甚至略有降低的趨勢(shì)，并且接枝度在蛋白濃度為25 mg/mL時(shí)以達(dá)到最高水平。這表明在蛋白與糖的質(zhì)量比一定時(shí)，隨著蛋白濃度的提高，蛋白質(zhì)分子與糖分子之間碰撞的機(jī)率增加，自由氨基更易與羰基結(jié)合，糖基化反應(yīng)更易發(fā)生；而當(dāng)?shù)鞍诐舛仍黾拥揭欢ǔ潭葧r(shí)，蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交聯(lián)，不利于糖基化反應(yīng)發(fā)生[24]。同時(shí)，糖基化反應(yīng)程度也受蛋白與糖比例的影響（圖1d），SPI-葡萄糖、SPI-木糖的DG 均隨著糖的比例的增加而增加，并且在蛋白與糖的比例大于1:1 時(shí)，有明顯提高。杜昱蒙等[24]也發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖添加量的增加，接枝度不斷增加。

2.2 糖基化反應(yīng)褐變程度分析

糖基化反應(yīng)常常會(huì)伴隨褐變現(xiàn)象的發(fā)生，隨著反應(yīng)的深入，顏色也越來(lái)越深，褐變產(chǎn)生的一類(lèi)物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為類(lèi)黑素，其最大吸收波長(zhǎng)在420 nm。因此，通過(guò)測(cè)定糖基化反應(yīng)產(chǎn)物在420 nm 的吸光度可以反映蛋白的褐變程度，從而間接反映出蛋白糖基化改性的程度[22]。

從圖2 可以看出，隨蛋白濃度增加，反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，糖的比例的增加，糖基化產(chǎn)物的褐變程度加深，進(jìn)一步說(shuō)明其糖基化反應(yīng)程度提高了。隨反應(yīng)條件的變化，相比于SPI-木糖，SPI-葡萄糖的褐變程度變化較為緩慢。由此看來(lái)，蛋白濃度對(duì)SPI-木糖褐變程度的影響程度比對(duì)其接枝度的影響程度高，而對(duì)SPI-葡萄糖的影響程度不大，木糖反應(yīng)體系較葡萄糖反應(yīng)體系更易發(fā)生褐變，而褐變程度的提高會(huì)影響蛋白產(chǎn)品的感官品質(zhì)。因此，想要使糖基化產(chǎn)物具有良好的色澤，選擇合適的糖基供體是關(guān)鍵，同時(shí)還可通過(guò)控制糖基化反應(yīng)的進(jìn)程來(lái)實(shí)現(xiàn)[23]。

圖2 不同反應(yīng)條件對(duì)SPI 褐變程度的影響Fig.2 Effects of different reaction conditions on the degree of browning of soybean isolate protein

為得到具有較高糖基化反應(yīng)程度、相似DG，并且褐變程度盡可能低的SPI-葡萄糖與SPI-木糖樣品進(jìn)行后續(xù)研究，以排除糖種類(lèi)之外其他因素干擾，綜合分析圖1 與圖2 的結(jié)果，選擇糖基化反應(yīng)條件。由于SPI-葡萄糖、SPI-木糖的DG 在所選的反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)呈現(xiàn)一直上升的趨勢(shì)（圖1），基于對(duì)糖基化反應(yīng)程度的考慮，確定反應(yīng)溫度90 ℃、反應(yīng)時(shí)間6 h。蛋白濃度25 mg/mL，SPI-葡萄糖與SPI-木糖的DG 均達(dá)到最高且無(wú)顯著差異，因此確定蛋白濃度為25 mg/mL。SPI 與葡萄糖的比例在1:3時(shí)，DG 較1:2 略高，但相差不大（P＞0.05），而1:2 時(shí)褐變程度明顯更低，因此，確定SPI-葡萄糖的蛋白與糖比例為1:2。同時(shí)，由于蛋白與糖比例為1:1 的SPI-木糖與1:2 的SPI-葡萄糖的DG 沒(méi)有顯著差異。因此，確定SPI-木糖的蛋白與糖比例為1:1。

2.3 糖基化改性大豆分離蛋白SDS-PAGE 分析

通過(guò)圖3 的電泳譜帶可以發(fā)現(xiàn)，β-伴大豆球蛋白（11S 球蛋白）的α亞基的分子量大小在78 kDa 左右、α'亞基的分子量大小在70 kDa 左右、β亞基的分子量大小在55 kDa 左右，大豆球蛋白（7S 球蛋白）的酸性多肽鏈A 的分子量大小在35 kDa 左右，堿性多肽鏈B 的分子量大小在18 kDa 左右[25]。在反應(yīng)溫度、蛋白與糖比例相同的情況下，反應(yīng)不同時(shí)間的SPI-葡萄糖、SPI-木糖的電泳圖譜顯示，隨著DG 的增加，亞基譜帶越來(lái)越淺，當(dāng)DG 增加到一定程度時(shí)，會(huì)有新的大分子量譜帶出現(xiàn)，說(shuō)明葡萄糖、木糖在糖基化反應(yīng)過(guò)程中與SPI 結(jié)合，形成高分子量產(chǎn)物[24,26-27]。糖基化改性程度越高的蛋白，亞基譜帶變淺越明顯。這一方面是因?yàn)殡娪灸z染色液中的考馬斯亮藍(lán)通過(guò)與蛋白質(zhì)分子中的自由氨基、巰基等活性基團(tuán)結(jié)合，從而將蛋白的亞基譜帶顯現(xiàn)出來(lái)，當(dāng)SPI 發(fā)生糖基化反應(yīng)后，自由氨基減少，從而減少了蛋白質(zhì)分子與考馬斯亮藍(lán)的結(jié)合，使得條帶顏色變淺[22,26]。另一方面也可能是大豆蛋白之間或大豆蛋白與葡萄糖、木糖交聯(lián)形成聚集物的結(jié)果，從而無(wú)法順利通過(guò)凝膠而卡在上方孔洞處[28]。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間、不同糖接枝蛋白的電泳圖譜Fig.3 Electrophoretic profiles of different reaction times and different glycograft proteins

由電泳圖譜還可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，SPI-木糖的7S 亞基首先消失，而11S 亞基，特別是其堿性亞基，比較難反應(yīng)，在SPI-乳糖接枝物中也有類(lèi)似現(xiàn)象[10]。這可能是因?yàn)?1S 堿性亞基中，參與糖基化反應(yīng)的主要氨基酸—賴(lài)氨酸和精氨酸含量較低[22]。

SDS-PAGE 方法也可以作為一種分析蛋白致敏性的方法，它快速簡(jiǎn)單、可實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)分析，并且具有高分辨力，但其準(zhǔn)確度較低，需要與其它方法結(jié)合分析。大豆蛋白的7S 組分的致敏性最強(qiáng)，根據(jù)電泳譜帶中7S 蛋白亞基的深淺，可以粗略判斷糖基化改性大豆分離蛋白的致敏性強(qiáng)度。SPI 糖基化改性程度越高，DG 越高，亞基譜帶顏色越淺，致敏性越低。

2.4 糖基化改性大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)2.1 與2.2 的結(jié)果，分別制備接枝度較高、褐變程度較低SPI-葡萄糖與SPI-木糖。用傅里葉變換紅外光譜分析糖基化改性大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[29]。結(jié)果如圖4 所示。從紅外譜圖可以看出，SPI 的糖基化產(chǎn)物在3300 cm-1左右處的峰更加明顯，這是因?yàn)?400 cm-1附近的-OH 鍵的伸縮振動(dòng)強(qiáng)度增加，使得羥基振動(dòng)峰增強(qiáng)，說(shuō)明經(jīng)大豆分離蛋白糖基化改性后，有糖分子接枝到蛋白分子上，使分子中-OH 增多[21]。SPI 的糖基化產(chǎn)物在1500 cm-1左右的兩個(gè)峰強(qiáng)度也發(fā)生了變化，這兩個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)著C=O 伸縮振動(dòng)和N-H 彎曲振動(dòng)，說(shuō)明糖基化反應(yīng)使大豆蛋白中的自由氨基減少[21]。在1800～500 cm-1范圍內(nèi)，糖基化改性大豆分離蛋白峰的強(qiáng)度和形狀與未改性SPI 有明顯差異，糖基化反應(yīng)產(chǎn)物在此范圍內(nèi)吸收更明顯，說(shuō)明蛋白質(zhì)和糖分子發(fā)生了共價(jià)結(jié)合。

圖4 SPI 及其糖基化產(chǎn)物的傅里葉紅外變換光譜Fig.4 FTIR of SPI and its glycosylated products

2.5 糖基化改性大豆分離蛋白的致敏性

ELISA 法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)未經(jīng)分離提取情況下食品進(jìn)行定性以及定量分析[21]。采用間接ELISA 法測(cè)定接枝度最高的SPI-木糖、SPI-葡萄糖樣品的致敏性。以未改性的SPI 為對(duì)照，視其致敏性為100%，致敏性降低程度為0，分析糖基化改性后SPI 相對(duì)于未改性SPI 的致敏性降低程度，結(jié)果如圖5。

SPI-木糖比SPI-葡萄糖的致敏性降低程度更高（P＜0.05）。這是因?yàn)镾PI-木糖的接枝度更高，糖基化改性程度更高，糖基化反應(yīng)能夠掩蓋大豆蛋白的過(guò)敏原表位，降低其致敏性。經(jīng)與木糖糖基化改性，SPI 的致敏性降低程度最高能達(dá)到50%左右[16]。糖基化改性的方法能使SPI 的致敏性有所降低，但其致敏性降低程度不高，由SDS-PAGE 圖譜（圖3）可以看出，當(dāng)糖基化反應(yīng)程度較高時(shí)，大分子量譜帶增多。因此，可能是隨糖基化反應(yīng)進(jìn)行，會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)后期的蛋白質(zhì)交聯(lián)，使大豆蛋白產(chǎn)生新的可以與IgE 抗體結(jié)合的表位，從而使蛋白質(zhì)的致敏性較糖基化反應(yīng)階段有所提升，致敏性降低程度達(dá)不到很高的水平[30]。

2.6 千頁(yè)豆腐的質(zhì)構(gòu)特性

分別以SPI、SPI-木糖和SPI-葡萄糖為主要原料，通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG 酶）交聯(lián)制作千頁(yè)豆腐，采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定其硬度、彈性、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性，結(jié)果如圖6。與SPI 制作的普通千頁(yè)豆腐相比，SPI-葡萄糖和SPI-木糖所制作低致敏千頁(yè)豆腐的硬度都更低（P＜0.05），咀嚼性也有所下降，但彈性與普通千頁(yè)豆腐沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明SPI-葡萄糖和SPI-木糖仍保有較好的功能特性。千頁(yè)豆腐硬度的降低與其含水量相關(guān)[3]，糖基化改性改變了大豆蛋白的結(jié)構(gòu)，并且引入更多糖側(cè)鏈，使其持水性等質(zhì)構(gòu)特性得到了改善[26]。因此，SPI-葡萄糖和SPI-木糖在蛋白交聯(lián)形成千頁(yè)豆腐凝膠時(shí)吸收了更多的水分，使產(chǎn)品的含水量更高，保水性較好，硬度更低，質(zhì)地更加柔軟，適口性更好。7S 和11S 蛋白的比例對(duì)大豆蛋白凝膠的硬度、彈性等也起著至關(guān)重要的作用，11S 組分含量越高，越有利于豆腐凝膠的形成[31-33]。通過(guò)SDS-PAGE 電泳圖可以看出，SPI-木糖與SPI-葡萄糖的11S 蛋白組分都部分參與了糖基化反應(yīng)，從而使所制得千頁(yè)豆腐的硬度降低，但糖基化程度更高的SPI-木糖的7S 組分破壞更徹底，這使得其11S 蛋白的比例更高，因而，與SPI-葡萄糖所制得的低致敏千頁(yè)豆腐相比，SPI-木糖所制作的低致敏千頁(yè)豆腐硬度適中、有較好的彈性和咀嚼性，并且具有更低的致敏性（圖5）。

3 結(jié)論

本文以SPI 為原料，通過(guò)濕法糖基化接枝葡萄糖、木糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖基化改性使SPI 和糖分子發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，SPI 的自由氨基減少，-OH 增多，致敏性最高的7S 亞基更易被糖基化。木糖比葡萄糖容易發(fā)生糖基化反應(yīng)，但也更容易發(fā)生褐變。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?5 mg/mL 時(shí)，SPI 的糖基化反應(yīng)程度最高，并且糖基化反應(yīng)程度與溫度、反應(yīng)時(shí)間、糖添加量成正相關(guān)。SPI-木糖的致敏性降低程度較SPI-葡萄糖高，可達(dá)50%，且以其為原料所制作的千頁(yè)豆腐也可具有良好的質(zhì)構(gòu)特性。這為實(shí)現(xiàn)糖基化改性大豆分離蛋白在低致敏千頁(yè)豆腐中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

糖基化改性能夠降低SPI 的致敏性，但程度不高，并且會(huì)使蛋白發(fā)生褐變，影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)，可通過(guò)控制美拉德反應(yīng)進(jìn)程，減少類(lèi)黑素的產(chǎn)生。大豆蛋白各個(gè)蛋白亞基致敏性的差異也有待進(jìn)一步探究。