基于分子動力學(xué)模擬與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討黃芩素抑制PD-1/PD-L1 相互作用的分子機(jī)制

郭 妍，郭怡琳，劉柏平 ，徐建國,

（1.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西太原 030031；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東廣州 510630；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部生物材料與能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510630）

程序性細(xì)胞死亡-1（programmed cell death-1，PD-1）是一種重要的免疫檢查點(diǎn)蛋白，可通過與配體PD-L1（programmed cell death ligand 1）結(jié)合抑制T細(xì)胞增殖，從而起到負(fù)向免疫調(diào)控作用以維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)[1]。然而腫瘤細(xì)胞能夠通過過量表達(dá)PDL1 逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，從而快速增殖、轉(zhuǎn)移。因此阻斷PD-1/PD-L1 通路可逆轉(zhuǎn)機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)，有助于提高T 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷力[2]。實(shí)際上，目前已有大量靶向PD-1 或PD-L1 的單抗抑制劑上市，且這些抑制劑在多種腫瘤臨床治療中取得了突破性進(jìn)展[3]，但單抗由于其較大的分子量而存在腫瘤滲透性差、穩(wěn)定性低以及研發(fā)成本高等局限性[4-6]。小分子（MW＜550 Da）抑制劑因可克服上述缺點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。2015 年，百時美施貴寶公司報道了一系列抑制活性較好（IC50為0.92 nmol/L～14.25 μmol/L）合成小分子。之后，Zak 團(tuán)隊(duì)闡明了該類小分子的抑制機(jī)制，指出小分子可作用于PDL1 表面并誘導(dǎo)PD-L1 的二聚最終結(jié)合到二聚體的內(nèi)表面，從而阻斷該通路[7-8]。

相比之下，天然的小分子抑制劑具有生物活性多樣、毒副作用低和來源廣泛等特點(diǎn)，為該通路抑制劑的發(fā)現(xiàn)提供了巨大寶庫[9]。黃芩素是一種天然黃酮類化合物，已有研究報道其可通過調(diào)控PD-L1 表達(dá)抑制PD-1/PD-L1 水平[10-11]，然而關(guān)于其能否直接抑制PD-1/PD-L1 相互作用及分子機(jī)制的研究鮮有報道。分子動力學(xué)模擬是利用計算機(jī)軟件，以經(jīng)典力學(xué)為基礎(chǔ)、分子隨時間變化的動態(tài)行為為模擬對象的一種方法，是研究分子間相互作用的重要工具[12]。事實(shí)上，分子動力學(xué)模擬已成功應(yīng)用于PD-1/PDL1 通路的研究。如Sun 等[13]和Shi 等[14]利用分子動力學(xué)模擬的方法研究了PD-L1 與單抗的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PD-L1 的CC'FG 結(jié)構(gòu)域?yàn)橹饕Y(jié)合區(qū)域。Verdura 等[15]通過分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可直接結(jié)合到PD-L1 dimer 內(nèi)表面從而阻斷PD-1/PDL1 相互作用。此外，本課題組前期的分子動力學(xué)模擬研究表明姜黃素等天然小分子能夠直接與PD-L1 dimer 的關(guān)鍵殘基結(jié)合從而抑制該通路[16-18]。

本文首先利用分子對接構(gòu)建PD-L1 dimer/黃芩素復(fù)合物體系，然后借助GROMACS 2016.4 軟件進(jìn)行150 ns 的分子動力學(xué)模擬。通過分析結(jié)合自由能、接觸數(shù)和非鍵相互作用等獲得黃芩素與PD-L1 dimer 的結(jié)合親和力、作用位點(diǎn)及作用類型等信息，從理論層面掌握其直接抑制PD-1/PD-L1 相互作用的分子機(jī)制。最后利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）對黃芩素的抑制作用進(jìn)行驗(yàn)證，這些數(shù)據(jù)有助于指導(dǎo)該通路天然小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃芩素（純度≥98%，HPLC）上海源葉生物科技有限公司；PD-1 酶聯(lián)免疫分析試劑盒、人源PD-1標(biāo)準(zhǔn)品 本生（天津）健康科技有限公司。

SHJ-4A 數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州國語儀器制造有限公司；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體系構(gòu)建及分子對接 根據(jù)文獻(xiàn)[7-8,15-16,18]調(diào)研結(jié)果，發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑直接抑制PD-1/PD-L1 相互作用的關(guān)鍵在于PD-L1 dimer 的形成與穩(wěn)定。基于此，首先從PDB 數(shù)據(jù)庫下載PD-L1 dimer/BMS-200（PDB ID：5N2F）和黃芩素（PDB ID：4X2A）的結(jié)構(gòu)。刪除水分子和配體BMS-200 得到PD-L1 dimer，并運(yùn)用WHAT IF 服務(wù)器修復(fù)其缺失部分，黃芩素則在Chem3D 軟件的MM2 力場下進(jìn)行能量最小化，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 PD-L1 dimer（a）和黃芩素（b）的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of the PD-L1 dimer (a) and baicalein (b)

然后利用AutoDock Tools 分別對PD-L1 dimer和黃芩素進(jìn)行加氫處理并生成pdbqt 文件，使用Grid Box 模塊將盒子大小設(shè)為20 ?×20 ?×20 ?，格點(diǎn)間距設(shè)為1 ?，其他參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值，最后運(yùn)行AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接[19]。選擇結(jié)合親和力最強(qiáng)的對接構(gòu)象作為分子動力學(xué)模擬的初始結(jié)構(gòu)。運(yùn)用PyMOL 軟件可視化對接結(jié)果，構(gòu)建相互作用3D 模式圖。為了考察黃芩素對PD-L1 dimer 構(gòu)象的影響，分別構(gòu)建含黃芩素和不含黃芩素的體系。為了簡便，將兩個體系分別稱為復(fù)合物和Dimer，PD-L1 dimer 的兩條鏈則分別命名為APD-L1 和BPD-L1。

1.2.2 分子動力學(xué)模擬 使用GROMACS 2016.4軟件進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，分別采用Amber ff99SB[20]和GAFF[21]描述蛋白和小分子的力場參數(shù)。首先將黃芩素和Dimer 體系置于立方體的溶劑盒子，并保證體系原子到盒子邊緣的距離不小于10 ?，隨后添加抗衡離子以保證體系呈電中性。緊接著采用最陡下降法和共軛梯度法對各體系進(jìn)行能量最小化，以使體系達(dá)到收斂狀態(tài)。然后依次進(jìn)行1 ns 的NVT 和1 ns 的NPT 平衡，使用V-rescale 耦合方法將溫度維持在300 K，使用Parrinello-Rahma 方法將壓力維持在1 atm。最后，體系在相同的參數(shù)下進(jìn)行150 ns 的模擬，并將快照以1.0 ps 為時間間隔保存至軌跡用于后續(xù)分析。模擬過程中，短程非鍵相互作用的截斷距離設(shè)為10 ?，長程靜電相互作用的計算采用Particle Mesh Ewald（PME）算法，氫原子的約束使用LINCS算法。

1.2.3 結(jié)合自由能 采用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積法（molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area，MM-PBSA）計算各體系的結(jié)合自由能[22]。從動力學(xué)最后30 ns 的平衡軌跡中采集300 幀構(gòu)象用于結(jié)合自由能（ΔG）計算，公式如下：

式中，Gcomplex、Gprotein和Gligand分別代表蛋白-配體復(fù)合物、蛋白和配體的自由能；EMM代表氣相中的分子力學(xué)能，包括范德華相互作用能（Evdw）和靜電相互作用能（Eele）；Gsol代表溶解自由能，可分解為極性溶解自由能（EPB）和非極性溶解自由能（ESA）兩部分。前者通過求解泊松-玻爾茲曼（Poisson-Boltzmann，PB）方程獲得，后者則通過計算分子表面面積（surface area，SA）而得，TΔS 為熵變對結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)。由于本文關(guān)注結(jié)合自由能的相對值，且熵變的計算耗時較長，因此不考慮熵變的影響。為了解黃芩素與PD-L1 dimer 作用過程中的關(guān)鍵殘基，本文采用與前期研究相同的方法對結(jié)合自由能進(jìn)行了分解[22-23]。

1.2.4 軌跡分析 使用GROMACS 2016.4 內(nèi)置分析工具和分子可視化程序1.9.3（Visual Molecular Dynamics，VMD）對模擬軌跡進(jìn)行分析。使用mindist 工具計算復(fù)合物體系的接觸數(shù)，截斷值設(shè)為6.0 ?。蛋白在模擬過程中二級結(jié)構(gòu)的變化利用dictionary of secondary structure of proteins（DSSP 2.0.4）工具進(jìn)行分析。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法描述蛋白原子運(yùn)動的相關(guān)性[24]。利用VMD 程序計算復(fù)合物體系分子間氫鍵占有率[25]，其中氫鍵的判定標(biāo)準(zhǔn)為受體-氫-供體的角度＞135°且受體-氫原子的距離＜3.5 ?。

1.2.5 ELISA 通過使用PD-1 ELISA 試劑盒測定反應(yīng)體系中PD-1 含量，計算黃芩素對PD-1/PD-L1相互作用的抑制率。具體操作步驟包括加樣：向空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔分別加入二甲基亞砜、標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品50 μL，37 ℃反應(yīng)30 min；加酶：用洗滌液洗板5 次，除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，37 ℃反應(yīng)30 min；顯色：用洗滌液洗板5 次，依次加入顯色劑A 和顯色劑B 50 μL，37 ℃避光反應(yīng)10 min；終止：加入終止液50 μL。最后以空白孔調(diào)零，450 nm波長處測定各孔的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.029x-0.0161，R2=0.997，標(biāo)準(zhǔn)品在0～60 ng/L 范圍內(nèi)線性良好。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)測定三次或以上，使用Microsoft Office Excel 2010 軟件進(jìn)行繪圖，采用SPSS 27 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05 代表差異顯著，試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 均方根偏差分析

通過計算黃芩素周圍20 ?范圍內(nèi)殘基的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值，可以考察體系在150 ns 分子動力學(xué)模擬過程中的穩(wěn)定性。對于Dimer 體系，選擇與復(fù)合物體系相同的殘基并計算其RMSD 值。由圖2 可知，兩個體系的RMSD值變化情況有所不同，復(fù)合物體系在3 ns 內(nèi)急速上升，之后波動幅度較小，隨著模擬時間的延長，穩(wěn)定在2.66 ?左右。Dimer 體系在5 ns 時突增至3.07 ?，5～30 ns 波動在3.50 ?左右，但30 ns 后，RMSD波動幅度較大，甚至高達(dá)5.35 ?，60 ns 后RMSD 值基本收斂至3.11 ?。說明復(fù)合物比Dimer 體系具有更高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。綜上，兩個體系均達(dá)到了平衡，可用于后續(xù)分析。

圖2 復(fù)合物和Dimer 體系在模擬過程中的均方根偏差Fig.2 Root mean square deviation results of the complex and Dimer systems during simulations

2.2 均方根波動分析

為了比較復(fù)合物和Dimer 體系在模擬過程中構(gòu)象柔性的差異，計算了PD-L1 dimer 殘基的均方根波動（root mean square fluctuation，RMSF）值，結(jié)果見圖3。整體來看，除少數(shù)區(qū)域外，兩個體系RMSF 的趨勢較為相似，但復(fù)合物比Dimer 體系具有更低的柔性。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)波動較大的殘基主要位于兩個體系的N 端、C 端和loop 區(qū)，其中Dimer 體系BC loop 區(qū)殘基RMSF 值達(dá)到了5 ?。復(fù)合物體系結(jié)構(gòu)柔性顯著較低的區(qū)域主要集中于β折疊結(jié)構(gòu)域，其RMSF 值僅為1～3 ?，如C-sheet（殘基54～59）、F-sheet（殘基121～124）和G-sheet（殘基110～117）。綜上，黃芩素的結(jié)合主要降低了sheet 區(qū)域的柔性，重要的是該區(qū)域?yàn)镻D-1 與PD-L1 的主要結(jié)合位點(diǎn)，這與以往的研究結(jié)果相似[7-8,15-16,18]。

圖3 模擬過程中APD-L1（a）和BPD-L1（b）殘基的均方根波動Fig.3 Root mean square fluctuation of each residue on theAPD-L1 (a) andBPD-L1 (b) during simulations

2.3 結(jié)合自由能分析

抑制劑與蛋白的結(jié)合自由能可用于描述兩者間結(jié)合親和力的強(qiáng)弱[26]。為了評估這一特性，本文利用g_mmpbsa 程序計算了黃芩素與PD-L1 dimer 的結(jié)合自由能，并詳細(xì)解析了相互作用成分的能量貢獻(xiàn)。由表1 可知，黃芩素與PD-L1 dimer 的ΔG 為-32.41±0.31 kcal/mol，說明兩者具有較強(qiáng)的結(jié)合親和力。相比之下，Dimer 體系的ΔG 為正值（36.11±0.89 kcal/mol），說明黃芩素是PD-L1 dimer 穩(wěn)定存在的必備條件。根據(jù)MM-PBSA 方法，ΔG 可表示為總極性能（ΔEpolar,total）和總非極性能（ΔEnonpolar,total）之和，兩者可進(jìn)一步分解為ΔEele+ΔEPB和ΔEvdw+ΔESA。復(fù)合物體系的ΔEvdw和ΔESA分別為-45.61±0.19和-3.41±0.03 kcal/mol，說明兩者均有利于黃芩素的結(jié)合。ΔEele也提供了-2.61±0.47 kcal/mol 的有利貢獻(xiàn)，但完全被不利于黃芩素結(jié)合的極性溶解自由能（19.22±0.60 kcal/mol）抵消，產(chǎn)生了不利于結(jié)合的總極性相互作用（16.61±1.07 kcal/mol）。綜上所述，總非極性相互作用是黃芩素與PD-L1 dimer 結(jié)合的主要驅(qū)動力，而總極性作用不利于結(jié)合，這類似于本人前期關(guān)于天然小分子抑制PD-1/PD-L1 相互作用的研究[23]。此外，黃芩素抑制該通路的能力近似于姜黃素，但強(qiáng)于白藜蘆醇和表沒食子兒茶素沒食子酸酯[23]。

表1 復(fù)合物和Dimer 體系的結(jié)合自由能（kcal/mol）Table 1 Binding free energies of the complex and Dimer systems (kcal/mol)

2.4 結(jié)合能分解

使用MM-PBSA 方法對總結(jié)合自由能進(jìn)行分解以識別對黃芩素結(jié)合有重要作用的殘基，結(jié)果見圖4。黃芩素與PD-L1 dimer 的6 個殘基產(chǎn)生了強(qiáng)于-1 kcal/mol 的相互作用，分別是ATyr56、AMet115、AAla121、BMet115、BAla121 和BAsp122。在這些殘基中，AMet115 與黃芩素的相互作用最強(qiáng)，作用能為-2.34 kcal/mol；ATyr56 次之，結(jié)合自由能貢獻(xiàn)為-1.49 kcal/mol；BAsp122 的貢獻(xiàn)最小，為-1.03 kcal/mol。此外，其他殘基如AIle54 和AIle116 對黃芩素的結(jié)合也起到了一定的作用，兩者的貢獻(xiàn)分別為-0.91 和-0.90 kcal/mol。綜上所述，Tyr56、Met115、Ala121 和Asp122 為復(fù)合物體系的關(guān)鍵殘基。本人前期的研究表明Tyr56 和Met115 為天然小分子姜黃素、白藜蘆醇和表沒食子兒茶素沒食子酸酯的關(guān)鍵結(jié)合殘基。類似地，Zak 等[7]和Ahmed 等[27]的研究表明，殘基Met115 和Tyr56 側(cè)鏈結(jié)構(gòu)重排有利于合成小分子結(jié)合。重要的是這些關(guān)鍵殘基也參與了PD-L1/PD-1 相互作用。綜上，從能量方面看，黃芩素可直接與PD-L1 dimer 穩(wěn)定結(jié)合。

圖4 復(fù)合物體系的殘基自由能分解Fig.4 Residue energy decomposition of the complex system

2.5 接觸數(shù)分析

為了確定黃芩素結(jié)合區(qū)域，計算了復(fù)合物體系的分子間接觸數(shù)，并將與黃芩素接觸數(shù)大于10 的殘基視為重要?dú)埢鵞28]。由圖5 可知，黃芩素主要結(jié)合在PD-L1 dimer 的4 個區(qū)域，分別為C-sheet（殘基54～56）、C'-sheet（殘基66～68）、F-sheet（殘基115～117）和G-sheet（殘基121～124）。其中，C-sheet 的殘基Ile54 和Tyr56 與黃芩素有很大的接觸數(shù)分布，Val55與黃芩素的接觸稍弱，但AVal55 的接觸數(shù)大于10。因此這三個殘基為該區(qū)域的重要?dú)埢'-sheet 三個殘基與黃芩素的接觸較弱，其中極性殘基AGln66 與黃芩素之間的接觸數(shù)最大，這主要來源于氫鍵的貢獻(xiàn)（圖6）。F-sheet 殘基與黃芩素的接觸數(shù)分布較大，其中非極性殘基AMet115 與黃芩素的接觸數(shù)為34。G-sheet 非極性殘基AAla121、BAla121 和極性殘基BAsp122 分別貢獻(xiàn)了30、36 和23 的接觸數(shù)，這與結(jié)合能分解結(jié)果一致。表2 為黃芩素與結(jié)合區(qū)域的接觸數(shù)。由表可知，復(fù)合物體系接觸數(shù)總和為389，這與姜黃素的相關(guān)結(jié)果類似[23]。此外，黃芩素與各結(jié)合區(qū)域的接觸數(shù)呈G-sheet＞F-sheet＞Csheet＞C'-sheet 趨勢，說明黃芩素與G-sheet 的結(jié)合最強(qiáng)，而與C'-sheet 的結(jié)合最弱。

表2 黃芩素與結(jié)合區(qū)域的接觸數(shù)Table 2 Contact numbers between baicalein and the binding domains

圖5 黃芩素與PD-L1 dimer 之間的接觸數(shù)Fig.5 Contact numbers of baicalein with the PD-L1 dimer

圖6 復(fù)合物體系的詳細(xì)結(jié)合模式Fig.6 Detailed binding mode of the complex system

2.6 非鍵相互作用分析

基于黃芩素的結(jié)構(gòu)，猜測其與PD-L1 dimer 之間的相互作用類型主要為氫鍵和疏水相互作用。因此首先對復(fù)合物體系分子間氫鍵占有率進(jìn)行了定量分析。如表3 所示，黃芩素O2 和O3 原子分別與殘基AVal55 和AGln66 形成占有率為15.28%和10.30%的氫鍵。表明氫鍵在模擬過程中不穩(wěn)定，這與靜電相互作用能結(jié)果一致（-2.61 kcal/mol）。然后對復(fù)合物體系的結(jié)合模式進(jìn)行了評價。如圖6 所示，黃芩素位于APD-L1 和BPD-L1 之間圓柱形結(jié)合口袋中，且被殘基BIle54、AMet115、AAla121、BMet115、BAla121、ATyr56、BAsp122、AVal55 和AGln66 的側(cè)鏈包圍，其中前5 個殘基與黃芩素形成了緊密的疏水相互作用。這與結(jié)合能分解結(jié)果一致地表明，殘基Tyr56、Met115、Ala121 和Asp122 可能是PD-1/PD-L1 通路天然的小分子抑制劑的潛在靶點(diǎn)。此外，相比于氫鍵，黃芩素的結(jié)合更依賴于苯環(huán)與疏水殘基之間的疏水相互作用。

表3 復(fù)合物體系的氫鍵占有率Table 3 Hydrogen bond occupancies of the complex system

2.7 互相關(guān)矩陣分析

為了探究黃芩素對PD-L1 dimer 原子運(yùn)動性的影響，計算了殘基Cα原子的互相關(guān)矩陣[29]。矩陣中對角線顏色表示殘基的運(yùn)動程度，對角線外紅色部分（正值）代表殘基間運(yùn)動呈正相關(guān)，即殘基間的動力學(xué)運(yùn)動方向一致。而藍(lán)色部分（負(fù)值）代表殘基間的運(yùn)動有負(fù)相關(guān)性，即殘基間的動力學(xué)運(yùn)動方向相反[30]。如圖7 所示，對角線尤其是殘基132～143 和242～250（分別對應(yīng)于APD-L1 的132-143 和BPD-L1 的132-141）顏色偏紅，說明兩個體系C 端殘基均具有較高的靈活性。此外，復(fù)合物體系藍(lán)色區(qū)域較少，而Dimer 體系藍(lán)色區(qū)域占據(jù)了矩陣大部分面積，說明該體系中APD-L1 和BPD-L1 之間殘基運(yùn)動具有更強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性。綜上，黃芩素可穩(wěn)定PD-L1 dimer 的結(jié)構(gòu)。

圖7 復(fù)合物（a）和Dimer 體系（b）Cα 原子的互相關(guān)矩陣Fig.7 Cross-correlation matrixes for Cα atoms in the complex(a) and Dimer systems (b)

2.8 二級結(jié)構(gòu)分析

利用DSSP 程序計算了黃芩素和Dimer 體系蛋白二級結(jié)構(gòu)隨時間的變化規(guī)律。如圖8 所示，Dimer體系的β-折疊，如殘基37～42、93～100 和104～114等（分別對應(yīng)于APD-L1 的殘基54～59、110～117 和121～123）穩(wěn)定存在于整個動力學(xué)模擬過程。殘基32～35（APD-L1 的殘基49～52）主要在3-螺旋和轉(zhuǎn)角之間相互轉(zhuǎn)變，其中3-螺旋出現(xiàn)的更頻繁，而殘基158～161（BPD-L1 的殘基49～52）表現(xiàn)出相反的動力學(xué)行為；殘基72～77 和198～204（分別對應(yīng)于APDL1 的殘基89～94 和BPD-L1 的殘基89～95）的二級結(jié)構(gòu)包括3-螺旋、α-螺旋和轉(zhuǎn)角；殘基116～126（APD-L1 的殘基133～143）的二級結(jié)構(gòu)在前84 ns 表現(xiàn)為α-螺旋，之后轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)角、3-螺旋和無規(guī)則卷曲；殘基242～249（BPD-L1 的殘基133～140）也包括這些二級結(jié)構(gòu)，但這些構(gòu)象時而出現(xiàn)時而消失，表明PD-L1 dimer 的C 端不穩(wěn)定。復(fù)合物體系二級結(jié)構(gòu)的組成類似于Dimer 體系，整個模擬過程中β-折疊構(gòu)象一直保持穩(wěn)定，其中C-sheet、F-sheet 和Gsheet 是PD-1 與PD-L1 的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域。因此可以推斷黃芩素能與PD-L1 dimer 穩(wěn)定結(jié)合從而抑制PD-1/PD-L1 相互作用。

2.9 PD-1/PD-L1 相互作用抑制率

為了闡明黃芩素對PD-1/PD-L1 相互作用的抑制能力，以BMS-202 為陽性對照進(jìn)行了ELISA 試驗(yàn)，結(jié)果見圖9。由圖9 可知，隨著BMS-202 和黃芩素濃度的增加，兩者對PD-1/PD-L1 相互作用的抑制率呈顯著升高趨勢（P＜0.05），且BMS-202 的抑制率始終大于黃芩素。當(dāng)濃度為6.25 μg/L 時，黃芩素對PD-1/PD-L1 通路的抑制率（17.95%±0.92%）與BMS-202 的抑制率（19.69%±0.85%）差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)濃度為50 μg/L 時，黃芩素與BMS-202 的抑制率分別達(dá)到43.43%和52.06%，差異顯著（P＜0.05）。黃芩素與BMS-202 對PD-1/PD-L1 相互作用抑制率的IC50分別為79.47 和44.29 μg/L，表明黃芩素對該通路較強(qiáng)的抑制作用[31-32]。

圖9 黃芩素對PD-1/PD-L1 相互作用的抑制率Fig.9 Inhibitory rate of baicalein on the PD-1/PD-L1 interaction

3 結(jié)論

本文利用分子動力學(xué)模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究了黃芩素抑制PD-1/PD-L1 相互作用的分子機(jī)制。構(gòu)象動力學(xué)結(jié)果表明，PD-L1 dimer 與黃芩素的結(jié)合在整個模擬過程中基本保持穩(wěn)定；結(jié)合自由能結(jié)果表明，黃芩素穩(wěn)定PD-L1 dimer 的能力較強(qiáng)為-32.41±0.31 kcal/mol；通過對結(jié)合能進(jìn)行分解，發(fā)現(xiàn)PD-L1 dimer 的4 個關(guān)鍵殘基Tyr56、Metl15、Ala121 和Asp122 對黃芩素結(jié)合有重要貢獻(xiàn)；結(jié)合模式和相互作用結(jié)果表明黃芩素主要結(jié)合在PD-L1 dimer 的Csheet、F-sheet 和G-sheet 區(qū)域，其中苯環(huán)與關(guān)鍵殘基間的非極性相互作用是復(fù)合物穩(wěn)定的主要因素；互相關(guān)矩陣和二級結(jié)構(gòu)結(jié)果進(jìn)一步表明，黃芩素可穩(wěn)定結(jié)合在sheet 區(qū)域。ELISA 結(jié)果表明黃芩素是PD-1/PD-L1 相互作用的有效阻斷劑。總之，這些信息有助于篩選PD-1/PD-L1 通路天然小分子抑制劑。