減量化修復(fù)地塊土壤微生物群落多樣性及影響因子初探

張書源

（1.上海市地礦工程勘察（集團(tuán)）有限公司，上海 200072；2.中國(guó)地質(zhì)學(xué)會(huì)城市地質(zhì)災(zāi)害防控技術(shù)創(chuàng)新基地，上海 200072）

上海“十四五”規(guī)劃建議，崇明堅(jiān)持生態(tài)優(yōu)先，綠色發(fā)展，持續(xù)推進(jìn)世界級(jí)生態(tài)島建設(shè)。為貫徹相關(guān)規(guī)定，政府計(jì)劃對(duì)崇明目前存在的不符合用地要求的土地進(jìn)行減量化處理，通過工程技術(shù)手段將其恢復(fù)成可供生態(tài)或農(nóng)業(yè)使用的地塊[1]。然而，環(huán)境效益較差的建設(shè)用地在減量化修復(fù)后，仍存在土壤質(zhì)量低和種植效益差等問題[2]，因此對(duì)修復(fù)后土壤的生態(tài)功能恢復(fù)情況值得深入探究。

對(duì)于減量化修復(fù)的地塊，往往側(cè)重于土壤肥力與土壤污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的研究，容易忽視土壤生態(tài)功能，而微生物作為土壤物質(zhì)循環(huán)與污染物降解的主要參與者，是土壤生態(tài)功能的重要指標(biāo)[3-4]。土壤受到污染后，環(huán)境因子會(huì)有直接變化，從而間接影響土壤生態(tài)系統(tǒng)，導(dǎo)致土壤肥力下降，微生物多樣性降低等現(xiàn)象[5]。受到土壤污染的影響，微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)也會(huì)隨之改變[6]。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)對(duì)土壤微生物群落展開研究，如：研究表明土壤環(huán)境因子如有機(jī)質(zhì)、重金屬等對(duì)土壤微生物多樣性和群落組成影響較大[7]；選取有機(jī)碳、全氮、酶活、微生物數(shù)量作為生態(tài)肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)有機(jī)物料能提高土壤酶活和微生物數(shù)量，從而提高土壤質(zhì)量[8]；土壤中的微生物可以通過一系列生長(zhǎng)代謝來降解有機(jī)污染物或轉(zhuǎn)化重金屬，以此來改善土壤環(huán)境，提高土壤質(zhì)量[9-10]。綜上，對(duì)于土壤微生物群落的研究已有一定基礎(chǔ)，但對(duì)于減量化修復(fù)地塊的物生物群落組成和結(jié)構(gòu)的研究鮮有報(bào)道。

本論文選取崇明區(qū)向化鎮(zhèn)某鋼廠的減量化地塊為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)研究減量化地塊修復(fù)前后土壤微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)影響，探討土壤減量化修復(fù)后理化性質(zhì)的變化與微生物群落的相關(guān)性，旨在為減量化修復(fù)地塊整治復(fù)墾和土壤健康管理提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及采樣點(diǎn)選取

研究區(qū)位于上海市崇明區(qū)向化鎮(zhèn)，位于崇明島東部，地勢(shì)平坦，地處亞熱帶，年平均氣溫大約為15.1 ℃，年平均降雨量約1020 mm，氣候溫和濕潤(rùn)，日照充足，四季分明，全鎮(zhèn)總面積53.78 km2，耕地面積4.12 萬畝（約27.47 km2）。向化鎮(zhèn)南北緊鄰長(zhǎng)江，屬島嶼水網(wǎng)地區(qū)，水源豐富。本研究選取崇明向化鎮(zhèn)某鋼廠減量化地塊進(jìn)行土壤監(jiān)測(cè)樣點(diǎn)布設(shè)，均勻選取三個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)：一個(gè)位于典型污染區(qū)（CM1）監(jiān)測(cè)點(diǎn)，兩個(gè)普通污染區(qū)（CM2、CM3）監(jiān)測(cè)點(diǎn)，并選取距離污染修復(fù)區(qū)500 m 以外的自然林地土壤作為對(duì)照點(diǎn)（CK），具體見圖1。

圖1 土壤采樣點(diǎn)位圖Fig.1 Soil sampling point map

1.2 采樣方法與指標(biāo)檢測(cè)

（1）采樣方法

2021 年7 月，選取典型污染區(qū)監(jiān)測(cè)點(diǎn)（CM1）和兩個(gè)普通污染區(qū)（CM2、CM3）監(jiān)測(cè)點(diǎn)，污染修復(fù)區(qū)500 m以外的自然林地土壤作為對(duì)照點(diǎn)（CK），每個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)區(qū)域采取三個(gè)土壤樣本，每個(gè)樣本用五點(diǎn)取樣法采取0～20 cm 耕作層土壤放入盆中混合，去除表層雜物、石塊等裝入無菌密封袋中，于4 ℃低溫保存，及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行土壤理化性質(zhì)、酶活及微生物檢測(cè)。

（2）指標(biāo)檢測(cè)

除常規(guī)指標(biāo)SOM、水溶性鹽總量、TN、AP、AK 指標(biāo)外，考慮到該地塊減量化修復(fù)后會(huì)進(jìn)行后續(xù)整理復(fù)墾工作，選取Fe、錳（Mn）、鋅（Zn）三個(gè)重金屬指標(biāo)來反映該鋼廠減量化后對(duì)照區(qū)和污染區(qū)土壤重金屬含量變化，選取脲酶（UE）、蔗糖酶（SC）、過氧化氫酶（CAT）、中性磷酸酶（NP）來表征土壤質(zhì)量變化，以便于研究土壤減量化修復(fù)后理化性質(zhì)的變化與微生物群落的相關(guān)性。

土壤理化指標(biāo)：SOM、水溶性鹽總量、TN、AP、AK、Fe、Mn、Zn，SOM 測(cè)定方法采用重鉻酸鉀氧化法；TN 測(cè)定方法采用半微量凱氏法；AP 測(cè)定方法采用鉬銻抗比色法；水溶性鹽總量測(cè)定方法采用重量法；AK 采用火焰光度法測(cè)定；Fe、Mn、Zn 測(cè)定方法為電感耦合等離子體發(fā)射光譜法。

土壤酶活指標(biāo)：選取UE、SC、CAT、NP 四種酶，測(cè)定方法參照《土壤酶及其研究法》[11]。

土壤微生物指標(biāo)：首先用DNA 試劑盒對(duì)土壤樣品中微生物DNA 進(jìn)行提取，再使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA 濃度和質(zhì)量，使用微生物16SrRNA 基因V3～V4 區(qū)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過QIIME 平臺(tái)進(jìn)行分析，將序列拼接后進(jìn)行質(zhì)控、冗余分析和測(cè)序，操作分類單元（OTU）抽平后分析使用[12-13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

原始數(shù)據(jù)處理采用EXCEL2020 計(jì)算分析，理化性質(zhì)和酶活的標(biāo)準(zhǔn)差及顯著性差異計(jì)算用SPSS 軟件分析完成，用R 軟件進(jìn)行主成分分析和差異分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 減量化修復(fù)對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

崇明減量化修復(fù)地塊與對(duì)照地塊土壤理化性質(zhì)如表1所示，CK 組的土壤SOM 含量顯著高于CM1 組、CM2 組、CM3 組（P＜0.05），分別高出2.08 倍、2.99 倍、1.51 倍；CK 組土壤TN 含量顯著高于CM1 組、CM2 組（P＜0.05），分別高出2.86 倍、1.74 倍；CK 組土壤AP 含量顯著高于CM1 組、CM2 組、CM3 組（P＜0.05），分別高出17.14 倍、14.80 倍、9.05 倍；CM1 組土壤中的含鹽量顯著高于其他點(diǎn)位（P＜0.05），高達(dá)8.33g/kg，分別是CK 組、CM2 組、CM3 組的22.51、20.83、19.37 倍。該修復(fù)場(chǎng)地之前為冷軋鋼廠，金屬類物質(zhì)含量較多，而金屬類物質(zhì)對(duì)土壤微生物、土壤中根際養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化吸收、植物作物具有多重影響，可直接或間接影響土壤的生態(tài)環(huán)境[14]。CM1 組的土壤Fe 含量顯著高于CK 組和CM3（P＜0.05），分別高出1.13倍和1.10倍，Mn和Zn無顯著性差異（P＞0.05），但CK 組Zn 含量高于CM1 組、CM2 組、CM3 組，說明典型污染區(qū)土壤重金屬含量較高，但減量化修復(fù)也有一定成效。整體來看，CK 組土壤SOM、TN、AP 含量高，間接體現(xiàn)出未被污染地塊土壤肥力保持能力較高。

表1 不同地塊土壤理化性質(zhì)Table 1 Soil physicochemical properties of different plots

2.2 減量化修復(fù)對(duì)土壤酶活性的影響

土壤酶活是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是土壤生態(tài)健康和質(zhì)量的重要生物指標(biāo)[15]，UE 在土壤中廣泛存在，土壤氮循環(huán)密切相關(guān)[16-17]；SC 和CAT 與土壤SOM 與微生物活性相關(guān)，可以表征土壤肥力與土壤質(zhì)量[18]，磷酸酶可以促進(jìn)土壤中磷素循環(huán)，也可以間接反映土壤生態(tài)健康[19]。崇明減量化修復(fù)地塊與對(duì)照地塊土壤酶活性如表2 所示，CK 組UE 活性高達(dá)742.12 μg/d/g，顯著高于CM1、CM2、CM3三組2.43倍、2.17倍、1.98倍（P＜0.05），污染修復(fù)區(qū)不同點(diǎn)位之間（CM1 組和CM3 組）也呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）；CK 組SC 活性高達(dá)33.25 mg/d/g，顯著高于CM1、CM2、CM3 三組16.79 倍、7.15 倍、3.03 倍，研究表明，SC 活性越高，土壤質(zhì)量越高[20]，說明對(duì)照組土壤質(zhì)量好于污染修復(fù)地塊；CK 組NP 顯著高于CM1、CM2、CM3 三組13.07 倍、9.63 倍、5.55 倍，土壤CAT活性四組無顯著性差異（P＞0.05）。整體來看，未被污染地塊酶活性較強(qiáng)，污染修復(fù)地塊經(jīng)修復(fù)后酶活性仍較低。有研究表明土壤酶活性受到土壤環(huán)境的影響較大[21-22]。

表2 不同地塊土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activities of different plots

2.3 減量化修復(fù)對(duì)土壤微生物多樣性和群落的影響

（1）土壤微生物多樣性分析

崇明減量化修復(fù)地塊與對(duì)照地塊土壤微生物多樣性可以通過多樣性指數(shù)表示，來反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，Shannon 指數(shù)表示微生物群落多樣性，Ace 指數(shù)表示微生物群落豐富度，Coverage 指數(shù)表示微生物群落覆蓋度。如表3 所示，CM1 組的Shannon 指數(shù)和Ace 指數(shù)均顯著低于其他三組（P＜0.05），CM1 組Shannon 指數(shù)顯著低于CK 組、CM2 組、CM3 組7.95%、9.54%、4.61%，CM1 組Ace 指數(shù)顯著低于CK 組、CM2 組、CM3 組9.70%、33.68%、22.70%，說明該地塊微生物多樣性和豐富度最差。結(jié)合土壤理化性質(zhì)和酶活性來看，CM1 酶活性較低，土壤質(zhì)量較差，說明污染物濃度高的地塊會(huì)抑制土壤酶活性，從而抑制微生物的生長(zhǎng)代謝[23]。Coverage 指數(shù)均在95%以上，表明樣本測(cè)序深度合理，滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析需求。

表3 不同地塊土壤微生物多樣性指數(shù)Table 3 Soil microbial diversity index of different plots

（2）土壤微生物群落PCoA 分析

選用主成分分析法來估算各樣本點(diǎn)序列間的距離，以此來分析污染修復(fù)點(diǎn)位和對(duì)照點(diǎn)微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。如圖2 所示，兩個(gè)主坐標(biāo)的解釋度分別為50.87%和26.99%，橫軸解釋度較高。CK 組和CM1 組分布在PC1軸的正負(fù)兩側(cè)，且與CM2 組，CM3 組未交集，說明CK 組、CM1 組與CM2 組、CM3 組群落結(jié)構(gòu)差異較大，CM2 組和CM3 組樣本點(diǎn)有重合，說明微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似。整體來看，對(duì)照組與污染修復(fù)區(qū)點(diǎn)位差異明顯，可能是由于土壤污染物濃度不同對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有所影響。土壤污染會(huì)一定程度上改變土壤結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，會(huì)影響土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分布[24]，修復(fù)后的土壤微生物生活環(huán)境發(fā)生變化，但減量化對(duì)土壤的修復(fù)程度是有限的。

圖2 不同點(diǎn)位土壤微生物群落PCoA 圖Fig.2 PCoA map of soil microbial community at different sites

（3）土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

將OTU 進(jìn)行物種分類學(xué)注釋后，共檢測(cè)到50 個(gè)門，不同點(diǎn)位土壤微生物的門水平相對(duì)豐度如圖3 所示，豐度最高的菌門為綠彎菌門（Chloroflexi）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）和厚壁菌門（Firmicutes）等，分別土壤細(xì)菌的16.62%～28.21%、15.50%～21.94%、10.10%～19.66%、6.51%～19.33%和4.12%～8.41%。藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）在CM1 中占比高達(dá)15.81%，但在對(duì)照組僅占0.40%，說明污染修復(fù)后可能有利于個(gè)別菌群相對(duì)豐度增加。污染修復(fù)地塊綠彎菌門（Chloroflexi）高于對(duì)照地塊，隨著污染程度加深，酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對(duì)豐度逐漸降低，與有關(guān)研究結(jié)果[25]一致。

圖3 不同點(diǎn)位土壤中微生物的相對(duì)豐度（門水平）Fig.3 Relative abundance of microorganisms at phylum level in different soil samples

共檢測(cè)到1057 個(gè)屬，不同點(diǎn)位土壤微生物的屬水平相對(duì)豐度如圖4 所示，CM1 優(yōu)勢(shì)菌屬為norank_f_A4b、Microcoleus_Es-Yyy1400、Bacillus、unclassified_o__Cyanobacteriales等，分別占細(xì)菌總數(shù)的7.17%、4.52%、3.40%、2.78%；CM2 優(yōu) 勢(shì) 菌 屬 為norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96、norank_f_A4b、Gaiella、norank_f__norank_o__Chloroplast等，分別占細(xì)菌總數(shù)的4.82%、3.35%、3.05%、2.90%；CM3 優(yōu) 勢(shì) 菌 屬 為norank_f__norank_o__SBR1031、Bacillus、Enterobacter、norank_f__norank_o__Chloroplast等，分別占細(xì)菌總數(shù)的4.02%、3.43%、3.42%、2.68%；CM4 優(yōu)勢(shì)菌屬為norank_f__Vicinamibacteraceae、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales、norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96、norank_f__Gemmatimonadaceae等，分別占細(xì)菌總數(shù)的6.65%、4.89%、3.42%、2.75%。

圖4 不同點(diǎn)位土壤中微生物的相對(duì)豐度（屬水平）Fig.4 Relative abundance of microorganisms at genes level in different soil samples

（4）環(huán)境因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究采用12 種環(huán)境因子來分析環(huán)境因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響如圖5 所示，主要影響微生物群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子為水溶性鹽總量、Fe、AK、AP、SC等。水溶性鹽總量對(duì)藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和變形菌門（Proteobacteria）有正相關(guān)作用，與放線菌門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）有負(fù)相關(guān)作用；SOM、NP 與變形菌門（Proteobacteria）、放 線 菌 門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）有正相關(guān)作用，與綠彎菌門（Chloroflexi）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）有負(fù)相關(guān)作用；AK、Fe、Mn 與變形菌門（Proteobacteria）、和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）有正相關(guān)作用，與綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）有負(fù)相關(guān)作用。

圖5 環(huán)境因子與微生物門水平相關(guān)性RDA 圖Fig.5 RDA diagram of correlation between environmental factors and microorganisms in phylum level

細(xì)菌作為土壤中最為豐富的微生物，對(duì)保持土壤生態(tài)健康至關(guān)重要。馮慧琳等[15]研究表明，土壤酶的產(chǎn)生主要來源于植物根系和土壤微生物，且土壤酶的主要來源之一是土壤微生物中的細(xì)菌，可以看出土壤酶與微生物存在密切關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，放線菌門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對(duì)豐度與土壤酶存在正相關(guān)關(guān)系，藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）與土壤酶存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明不同門類細(xì)菌的作用方式有差異性。且污染修復(fù)土壤與對(duì)照組土壤污染物濃度不同，理化性質(zhì)也會(huì)有所不同，進(jìn)而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[26]。

土壤環(huán)境因子與微生物群落相關(guān)性分析如圖6 所示，Heatmap 圖顯示了環(huán)境因子對(duì)研究區(qū)域土壤微生物的影響程度。酸桿菌門（Acidobacteriota）、Latescibacterota、Myxococcota、NB1-j 與AP、UE、SC 和NP 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），浮霉菌門（Planctomycetota）、酸桿菌 門（Acidobacteriota）和Latescibacterota 與 水 溶 性 鹽總量、Fe 和Mn 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）與TN、AP、UE、SC 和NP 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與水溶性鹽總量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），擬桿菌門（Bacteroidota）與Fe 和AK 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），放線菌門（Actinobacteriota）與AK 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。相關(guān)研究表明重金屬與細(xì)菌多樣性具有一定的相關(guān)性[27]，與本研究研究結(jié)果一致。

圖6 環(huán)境因子與微生物門水平相關(guān)性Heatmap 圖Fig.6 Heatmap diagram of correlation between environmental factors and microorganism in phylum level

AP、UE、SC、NP、水溶性鹽總量和Fe 與土壤微生物群落存在較強(qiáng)的相關(guān)性，表明環(huán)境因子的改變影響某些微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)，而微生物群落結(jié)構(gòu)的改變也會(huì)反過來作用于土壤環(huán)境因子，二者具有一定的關(guān)聯(lián)性。

3 結(jié)論

本研究選取崇明某減量化修復(fù)地塊采集土壤樣品，采用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)，分析土壤理化性質(zhì)與酶活性對(duì)污染修復(fù)地塊微生物群落組成的影響，主要結(jié)論如下：

（1）CK 組SOM、TN 和AP 含量顯著高于污染區(qū)（CM1組、CM2 組、CM3 組）（P＜0.05），CM1 組重金屬含量較高，說明未被污染地塊土壤肥力保持能力較高。CK組UE、SC、NP 均顯著高于CM1 組、CM2 組、CM3 組（P＜0.05），說明未被污染地塊酶活較強(qiáng)，土壤酶活性受環(huán)境因子影響較大。

（2）CM1 組的Shannon 指數(shù)和Ace 指數(shù)均顯著低于其他三組（P＜0.05），說明該地塊微生物多樣性和豐富度最差，污染物濃度高的地塊會(huì)抑制土壤酶活性，從而抑制微生物的生長(zhǎng)代謝。

（3）豐度最高的菌門為綠彎菌門（Chloroflexi），占比為16.62%～28.21%，CK 組與CM1 組土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，說明環(huán)境因子會(huì)影響微生物群落結(jié)構(gòu)，且放線菌門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對(duì)豐度與土壤酶活存在正相關(guān)關(guān)系，藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）與土壤酶存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明不同門類細(xì)菌的作用方式也具有差異性，土壤理化性質(zhì)與微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定的關(guān)聯(lián)性。主要影響微生物群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子為水溶性鹽總量、Fe、AK、AP、SC 等。減量化修復(fù)對(duì)改善土壤理化性質(zhì)、酶活性及物生物群落有一定的影響，在提升土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量有重要意義，但對(duì)于后續(xù)復(fù)墾及農(nóng)業(yè)種植需要設(shè)計(jì)更加完備的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。