基于網絡藥理學和分子對接技術探討半夏治療糖尿病胃輕癱的作用機制※

黃嘉家,肖雅松,葉金鑫,林 青,張榮華

(1.暨南大學,廣東 廣州510632;2.廣東省中醫藥信息化重點實驗室,廣東 廣州 510632)

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis,DGP)是一組以胃排空延遲和上消化道癥狀為特征的綜合征,為糖尿病主要并發癥之一,臨床表現為腹脹、惡心、嘔吐等。目前糖尿病患者中DGP發病率已高達60%,嚴重影響患者的生活質量[1-3]。中醫認為,DGP屬“消渴”“痞滿”“嘔吐”范疇,病機多為脾胃虛弱、氣機阻滯、痰濕水飲停聚,故多治以健脾和胃、行氣化痰[4]。理氣化痰類中藥具有理氣止嘔、化痰消痞等功效,為治療DGP的重要切入點。

半夏為天南星科植物半夏[PinelliaeRhizoma(Thunb.)Breit.]的干燥塊莖,具有燥濕化痰、散結消痞、降逆止嘔之效。半夏是半夏瀉心湯、小半夏湯與半夏厚樸湯等諸多治療DGP常用方劑的君藥,眾多學者采用系統聚類分析、關聯規則、因子分析等方法研究古今臨床治療DGP的用藥規律,發現半夏為臨床治療DGP應用較多的藥物之一[5-8]?？梢?半夏是中藥治療DGP的重要組成藥物?，F代研究顯示,半夏具有止嘔、抗潰瘍、抗炎、調節胃腸功能等作用,既可通過中樞性抑制和激活迷走神經以止嘔,還可通過抑制胃酸分泌和胃蛋白酶活性以減緩胃腸道反應[9-12]。然而,半夏治療DGP的具體作用機制尚未深入探討,有待進一步研究。網絡藥理學是預測、評估藥物治療疾病作用機制的有效方法,分子對接技術可進一步為藥物靶點研究提供技術支持。本研究采用網絡藥理學和分子對接技術探討半夏治療DGP的物質基礎及網絡作用機制。

1 資料與方法

1.1 半夏活性成分的篩選與靶點預測 在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索半夏的化學成分,以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為參數,篩選半夏的活性成分及其對應的靶點基因;利用PubChem數據庫下載活性成分SDF格式文件,輸入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中預測其靶點基因。整合TCMSP與SwissTargetPrediction預測的靶點基因,去重,獲得半夏活性成分的作用靶點。

1.2 DGP相關靶點的篩選 在Genecards(https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)及NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中分別以“Diabetic gastroparesis”或“Delayed gastric emptying”為關鍵詞,篩選DPG相關靶點基因。

1.3 半夏活性成分-DGP交集靶點網絡的構建 利用Venny 2.1在線軟件獲取半夏活性成分靶點與DGP相關靶點的交集靶點;借助Cytoscape 3.8.0軟件構建“半夏活性成分-交集靶點”網絡圖。計算各節點連接數,評估網絡中各節點的相互聯系程度。

1.4 PPI網絡的構建與拓撲分析 基于Cytoscape 3.8.0的BisoGenet 3.0插件中的DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、NINT、BIND數據庫,定義參數為“Homosapiens”,對1.3獲得的交集靶點進行蛋白互作(PPI)網絡構建。借助Cytoscape 3.8.0的CytoNCA插件,對PPI網絡進行拓撲分析,以節點的度中心性(DC)、介數中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、局部平均中心性(LAC)、網絡中心性(NC)6個參數作為參考標準,篩選DC值排名前50的靶點,再依據DC、BC、CC、EC、NC、LAC參數篩選PPI網絡的核心靶點。

1.5 GO和KEGG富集分析 將1.4得到的核心靶點輸入Cytoscape 3.8.0中的ClueGO插件中,進行基因本體(GO)功能富集和京都基因組與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析(P<0.05,FDR<0.05),構建“核心靶點-KEGG信號通路”網絡圖。

1.6 分子對接 選取高DC值的核心靶點和活性成分,分別作為對接蛋白和對接配體,同時以臨床上常用于治療DGP的藥物西沙必利作為陽性對照配體。其中,對接蛋白3D結構從PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)中下載,去除原配體;活性成分和陽性對照配體的mol2文件從ZINC數據庫(http://zinc15.docking.org/)下載,利用Autodock 4.2軟件進行分子對接,并用PyMOL 2.4軟件將對接結果可視化。

2 結果

2.1 半夏有效成分與DGP相關靶點篩選 從TCMSP數據庫獲得半夏的13個活性成分,見表1。整合TCMSP與SwissTargetPrediction獲得半夏活性成分靶點基因共461個。從Genecards、TTD、NCBI數據庫分別得到與DGP相關靶點429、5、19個,合并與刪除重復項后得到388個。將半夏活性成分靶點與DGP相關靶點進行交集,獲得68個交集靶點,見圖1。

圖1 半夏-糖尿病胃輕癱潛在靶點韋恩圖

表1 半夏活性成分

2.2 “半夏活性成分-交集靶點”相互作用網絡分析 “半夏活性成分-交集靶點”網絡圖如圖2所示,相互作用關系包括81個節點和165條邊。13個活性成分的DC值中位數為11,預示半夏多數活性成分可作用于多個DGP相關靶點。其中DC值較高的活性成分為MOL002714(黃芩素)、MOL006957[環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)]和MOL000358(β-谷甾醇)。

圖2 “半夏活性成分-交集靶點”網絡圖

2.3 PPI網絡的構建與拓撲分析 交集靶點的PPI網絡構建圖如圖3A所示,PPI網絡包含4 711個節點和115 417條邊。利用Cytoscape 3.8.0的插件CytoNCA,對PPI網絡各節點的拓撲參數DC、BC、CC、EC、NC、LAC值進行計算,篩選獲得327個節點構成的核心靶點網絡(圖3B、3C)(圖3見本期第125頁)。

注：A為交集靶點的蛋白質相互作用(PPI)網絡圖;B為經度中心性(DC)>7初步篩選后的PPI網絡圖;C為核心靶點網絡圖,其中紅色部分為半夏與DGP的交集靶點。

2.4 GO和KEGG富集結果 對PPI核心靶點進行GO功能富集分析共得到2 324個條目,其中細胞組分(CC)、分子功能(MF)、生物途徑(BP)分別有239、224、1 861個條目。如圖4所示,核心靶點的CC主要與黏著斑、細胞-基質黏附連接、細胞-基質連接等作用相關,MF主要與泛素蛋白連接酶結合、泛素-類蛋白連接酶結合、細胞黏附分子結合等作用相關,BP主要有mRNA分解代謝過程、RNA分解代謝過程、細胞周期調控等。核心靶點的KEGG通路富集分析得到148條信號通路,包括細胞周期、甲狀腺激素信號通路和低氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路等,見圖4。KEGG通路富集分析結果中排名前20條通路的核心靶點有157個,其中12個是半夏活性成分靶點和DGP疾病靶點的交集靶點,根據其在KEGG關系網絡圖中的DC值排序為絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、蛋白激酶1(AKT1)、JUN原癌基因(JUN)、信號轉導及轉錄激活蛋白(STAT3)、絲裂原活化酶2(CDK2)、非受體酪氨酸激酶(SRC)、人表皮生長因子受體(EGFR)、缺氧誘導因子-1A(HIF1A)、雌激素受體(AR)、環狀素受體1(ESR1)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶6(AURKA),見圖5。

注：圖A、B、C分別為基因本體(GO)功能富集分析的生物途徑(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)結果;圖D為京都基因組與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析結果。

注：三角形代表京都基因組與基因組百科全書(KEGG)通路富集信號通路;方形代表核心靶點。

2.5 分子對接結果 選擇MAPK1、AKT1為對接蛋白,黃芩素和環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)為對接配體,另外選擇西沙必利為陽性對照配體。對接蛋白與對接配體的結合能越低,代表形成的分子對接結構結合活性越強。分子對接結果模式如圖6所示,兩個活性成分和陽性對照配體與核心蛋白MAPK1、AKT1均有良好的親和力,除環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與AKT1外,其他結合模式均能通過氫鍵結合。

注：圖A、B、C分別代表黃芩素、環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)、西沙必利與絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的對接情況;圖D、E、F分別代表黃芩素、環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)、西沙必利與蛋白激酶1(AKT1)的對接情況。

黃芩素和環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與MAPK1的結合能均低于陽性對照配體西沙必利,其中環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與MAPK1結合能更低,提示環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與MAPK1有更強的結合活性;黃芩素和環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與AKT1的結合能均低于陽性對照配體西沙必利,其中黃芩素和AKT1的結合能更低,提示黃芩素與AKT1有更強的結合活性。分子對接結合能見表2。

表2 半夏關鍵有效成分和核心靶點蛋白的分子對接結合能(kcal/mol)

3 討論

DGP癥見嘔吐、腹脹、噯氣、惡心等,屬中醫“消渴”“痞滿”“嘔吐”等范疇,病機為消渴日久,氣血虧虛,使脾胃運化無力,氣機升降失調,以致胃氣上逆,氣滯痰阻。臨床治療DGP多采用調和脾胃、消痞化痰、健脾益氣之和、消、補法[6]。半夏具有化痰止嘔、散結消痞之功,兼具和、消、補之效,為臨床治療DGP的常用中藥[5-6]。本研究運用網絡藥理學與分子對接技術從多成分、多靶點、多通路的網絡角度探究半夏治療DGP的作用機制。

本研究共篩選出與DGP相關的活性成分13個,其中黃芩素、β-谷甾醇、環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)的靶點連接度較高,在半夏治療DGP中發揮主要作用。研究發現,黃芩素對糖尿病有一定治療作用。LI Y K等[13]應用黃芩素干預鏈脲霉素誘導的胰島素缺乏糖尿病大鼠,發現黃芩素能降低糖尿病大鼠空腹血糖、隨機血糖和血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)含量;黃芩素還可通過降低皮質中脂氧合酶的表達,影響p38 MAPK及其磷酸化酶的合成,抑制p38 MAPK介導的細胞凋亡而發揮保護神經作用,減少部分糖尿病并發癥的發生。黃芩素還具有類固醇激素作用,可通過介導α2-腎上腺素受體、前列腺素和三磷酸腺苷(ATP)敏感性鉀通道,減少Cajal間質細胞的炎性反應,激活Cajal間質細胞的抗氧化過程,增加黏液分泌,發揮胃保護作用[14-15]。環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)為半夏特有成分,是一種哌嗪二酮類化合物,是治療糖尿病胃輕癱的潛在化合物,然其相關研究甚少,值得進一步探究。β-谷甾醇可通過提高血清中一氧化氮含量,提高受損胃黏膜的修復能力;通過降低內皮素1水平,發揮抗胃潰瘍作用[16-17]。因此,半夏發揮藥效的物質基礎與黃芩素、β-谷甾醇等有效成分密切相關。

KEGG通路富集分析結果顯示,MAPK1、AKT1及JUN等是半夏治療DGP的重要靶點。MAPK1是一種線粒體活化蛋白激酶,是胰島素信號通路的關鍵因子之一,與葡萄糖的轉運和代謝密切相關,在胰島素抵抗中發揮重要作用[18-19]。MAPK是成纖維細胞生長因子21(FGF21)下游的關鍵激酶,可通過磷酸化靶蛋白抑制肝臟對糖的輸出,增加飽腹感并抑制糖分攝入,起控制血糖的作用[20-21]。研究顯示,p38/MAPK的激活可促進雌激素受體轉移至細胞核,并與雌激素反應元件結合,維持機體胃排空功能[22]。AKT參與細胞的凋亡、周期進展及葡萄糖和脂質代謝等過程,與DGP的發生密切相關。研究顯示,AKT可通過抑制叉頭框蛋白O1(FoxO1)的表達,刺激己糖激酶將葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸鈉鹽,從而降低血糖水平[23]。AKT與p-AKT蛋白含量的高低影響胃排空率和小腸推進率,與胃腸激素的調節、胃腸動力密切相關[24-25]。研究顯示,AKT的磷酸化可降低鏈脲霉素誘導的糖尿病小鼠胃Cajal間質細胞的丟失,抑制Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9的表達及胃Cajal間質細胞的凋亡[26-27]。因此,MAPK1、AKT1等靶點與DGP密切相關,為半夏發揮抗DGP的重要靶點。

KEGG通路富集分析結果亦顯示,甲狀腺激素信號通路和HIF-1信號通路可能為半夏治療DGP的關鍵通路。研究發現,甲狀腺激素可激活胰島素信號通路的上游因子胰島素受體底物-1(IRS-1),降低2型糖尿病模型小鼠血糖水平,提高糖尿病小鼠胰島素敏感性和血漿胰島素水平[28]。此外,甲狀腺激素可通過直接作用于胃腸道平滑肌及兒茶酚胺刺激胃腸道運動[29]。鐘鳳等[30]研究發現,甲狀腺內有胃動素免疫陽性細胞,胃動素與降鈣素共存并表達于甲狀腺C細胞。HIF可通過控制糖酵解限速步驟誘導細胞糖酵解[31]。研究顯示,HIF-1α在DGP大鼠胃黏膜中表達增加,可提高1型糖尿病大鼠胃黏膜血管的通透性,是調控DGP胃排空延遲的關鍵因子[32]。因此,半夏可能通過甲狀腺激素和HIF-1等信號通路,調控血糖、促進胃腸道運動、逆轉胃排空延遲、增加胃黏膜血管的通透性等發揮抗DGP的作用。

本研究初步推測半夏主要通過黃芩素、β-谷甾醇、環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)等活性成分發揮調控血糖、促進胃腸道運動、逆轉胃排空延遲等作用,從而達到治療DGP的目的。分子對接結果提示,黃芩素、環(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)可與MAPK1和AKT1結合,調控HIF-1信號通路和甲狀腺激素信號通路,這可能為半夏防治DGP的重要機制,值得進一步探索。

中藥的藥效物質基礎是一個由多種成分構成的藥效組分群,可通過網絡交叉產生整體的藥效作用,與以整體性、系統性為研究特色的網絡藥理學不謀而合。在廣泛的中藥網絡藥理學研究中,中藥活性成分主要按OB≥30%、DL≥0.18為標準進行篩選,并驗證了許多具有藥效作用的成分及其相關作用機制。然而,該篩選方法也存在弊端,如不同性狀的中藥在機體不同的生理病理狀態下,吸收、分布、代謝及排泄的過程是不完全相同的。因此,基于血清代謝組學等方法研究中藥在患者或疾病模型動物中的有效成分及代謝產物,并基于這些吸收、代謝成分開展網絡藥理學的研究更符合藥理學研究。半夏的主要成分包括生物堿類、有機酸類、蛋白質類、核苷類、氨基酸類、揮發油類、甾醇類及蛋白質類等,但其相關特異性藥效成分在體內的代謝過程,以及相關作用機制研究甚少,以單味中藥治療DGP的研究尚未見報道[33]。半夏是臨床防治DGP的重要中藥,但其作用機制仍未具體研究。因此,本研究仍基于廣泛應用的活性成分篩選方法,基于現有的半夏化學成分進行初步篩選,以期初步探索半夏治療DGP的潛在作用機制,為進一步的研究提供參考。