大黃魚中大腸菌群測量不確定度評定

林 毅，吳文學，張悅琳，朱品玲

（1.福州海關技術中心，福建 寧德 352100；2.南平市食品藥品檢驗檢測中心，福建 南平 353000）

大腸菌群是指在一定條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌[1]。大腸菌群與菌落總數、霉菌等常作為評價食品衛生指標之一[2-4]，大腸菌群包括大腸桿菌和產氣桿菌等，這些細菌寄居于人及恒溫動物腸道內，隨大便排出體外。食品中的大腸菌群常作為食品受糞便污染程度指標，具有廣泛的意義。

ISO/IEC 17025 :2017[5]、 《CNAS-CL01-A001 :2022》[6]等規范性文件中對測量不確定度做出要求，如《CNAS-CL01-A001 :2022》 條款7.6《測量不確定度的評定》中規定“對于定量（平板計數法） 微生物檢測方法實驗室應分別進行不確定度評定”，對微生物定量檢測方法測量不確定度要求進一步加強。不確定度是根據所用到的信息，表征賦予被測量值分散性的非負參數[7]，不確定度由一些不可避免因素組成，其數值代表檢測結果不能肯定程度的大小，不確定度越小，測量值與真實值越接近。對大腸菌群檢測結果進行不確定度分析是實驗室質量控制的重要組成部分，使實驗室檢測結果更可靠，更具科學性、公正性。

根據同一試驗人員在相同條件下對1 份大黃魚樣品重復檢測18 次，依據JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[7]、RB/T 151—2016《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》[8]、GB/T 27418—2017《測定不確定度評定和表示》[9]、CNASCL01-G003《測量不確定度的要求》[10]、GB/T 27420—2018《合格評定 生物樣本測量不確定度評定與表示應用指南》[11]，對檢測過程中的不確定度分量進行統計分析，對檢測數據進行不確定度分析。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

檢測依據GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》[1]第二法 大腸菌群平板計數法進行測試。樣品處理：GB/T 4789.20—2003《食品衛生微生物學檢驗 水產食品檢驗》[12]。

1.2 試驗材料

樣品：大黃魚（人工污染，添加大腸埃希氏菌標準菌株：ATCC 25922）；NaCl（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；VRBA 瓊脂、BGLB 肉湯，北京陸橋技術股份有限公司提供。試劑耗材經驗收合格且在有效期內。

1.3 試驗步驟

稱取25 g 樣品置于225 mL 生理鹽水中，充分均質，制成1∶10 的樣品稀釋液。

用1 mL 無菌移液器吸取1∶10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩緩注入盛有9 mL 生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），混合均勻，制成1∶100 的樣品勻液。根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10 倍遞增系列樣品稀釋液。

選擇2～3 個連續的適宜稀釋度樣品均液，每個稀釋度接種2 個平皿，每皿1 mL 樣品均液，同時設置空白對照，每皿傾倒15～20 mL VRBA 培養基，旋轉平皿使培養基與樣品充分混勻。在培養基凝固后加入3～4 mL VRBA 覆蓋平板表層，翻轉平板，置于（36±1） ℃下培養18～24 h。

選取菌落數在15～150 CFU 的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。

從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，少于10 個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于BGLB 肉湯管內，（36±1） ℃下培養24～48 h，觀察產氣情況。凡BGLB 肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。

2 數學模型

式中：Y——樣品中的大腸菌群菌落數，CFU/g；

N——計數稀釋度的大腸菌群菌落數，CFU/g；

V——所加樣品稀釋液的體積，mL；

D——計數樣品稀釋液的稀釋倍數；

A——計數稀釋度典型與可疑大腸菌群菌落數，CFU/g；

B——被證實的大腸菌群陽性比率，%。

此次不確定度評定添加大腸埃希氏菌標準菌株，樣品在VBRA 平板上生長的典型菌落、可疑菌落均為大腸菌群，因此可不做確認試驗；同時，根據GB 4789.3—2016 每一稀釋度平皿加入的稀釋液體積都為1 mL，因此上述公式（1） 可簡化為：

3 不確定度來源

測量不確定度來源于對檢測結果產生影響的所有過程分量，其中對在規定測量條件下測得的量值統計分析得到測量不確定度分量評定稱為測量不確定度的A 類評定，用不同于測量不確定度A 類評定的方法對測量不確定度分量進行的評定稱為測量不確定度的B 類評定[7]。其中，A 類不確定度來源于重復檢測操作過程，B 類不確定度來源于樣品處理、稀釋、加樣體積等過程。

測量不確定度來源分析見表1。

表1 測量不確定度來源分析

4 不確定度評定

4.1 樣品重復檢測引入的不確定度

在一定條件下，由同一個試驗人員對同一樣品進行檢測，為提高自由度，對同一樣品重復測量18 次。

同一樣品18 次重復測量結果見表2。

表2 同一樣品18 次重復測量結果

由表2 中檢測結果可知，檢測結果相差較大，發散性大，如果直接根據檢測結果計算得到的標準偏差評定相應的測量不確定度，其樣本不確定度較大，不合理，因此將檢測結果取對數值[13-14]，計算樣本的試驗標準偏差并根據貝塞爾公式得到樣本平均值的標準偏差，即樣品A 類標準不確定度。

n——樣品檢測次數。

4.2 樣品處理引入的不確定度

4.2.1 天平引入的不確定度

根據GB 4789.3—2016[1]，樣品處理：25 g 樣品加入225 mL 生理鹽水（稀釋液） 中制成1∶10 稀釋液。使用天平稱取25 g 樣品，根據天平檢定證書在0～500 g 內最大允許誤差為±0.05 g，取均勻分布，則天平稱量引入的標準不確定度為：

稱取25 g 樣品引入的相對標準不確定度為：

4.2.2 量筒引入的不確定度

樣品處理過程使用量程為250 mL 的量筒量取225 mL 生理鹽水，根據JJG 196—2006[15]，250 mL量筒的最大允許誤差為±2.0 mL，取均勻分布，得250 mL 量筒引入的標準不確定度為：

量取225 mL 生理鹽水引入的相對標準不確定度為：

4.2.3 樣品處理引入的相對標準不確定度

4.3 樣品稀釋引入的不確定度

根據GB 4789.3—2016[1]，樣品稀釋：取1 mL 的1∶10 稀釋液加入9 mL 生理鹽水中制得1∶100 稀釋液。該過程用到1 mL，10 mL 量程移液槍分別移取1 mL，9 mL 液體，根據JJG 646—2006[16]，1 mL，10 mL 移液槍允許誤差±0.01 mL，±0.06 mL，取均勻分布，則1 mL，10 mL 移液槍引入標準不確定度分別為：

1 mL，10 mL 移液槍引入的相對不確定度分別為：

樣品稀釋引入的相對不確定度：

4.4 樣品加樣體積引入的不確定度

根據GB 4789.3—2016，接種時每個稀釋度接種2 個無菌平皿，每個平皿接種1 mL。根據JJG 646—2006[16]，1 mL 移液槍允許誤差為±0.01 mL，取均勻分布，標準不確定度及相對標準不確定度參考4.3 中V2，其中標準不確定度為：

樣品加樣體積引入的相對不確定度為：

4.5 相對合成標準不確定度及擴展不確定度

4.1～4.4 中引入的不確定度因素都是相互獨立的，則合成標準不確定度為：

根據JJF 1059.1—2012 附錄B，取置信概率p=95%，自由度v=18-1=17，查表得k=tp（v）=t95（17）=2.11，則擴展不確定度為：

5 結論

從上述不確定度計算的結果可以看出，上述分量對不確定度均產生影響，但部分分量影響較小，可忽略不計。其中，B 類不確定度（樣品處理、稀釋、加樣體積） 對合成不確定度貢獻較小，A 類（重復測量） 不確定度分量較大，因此為方便測量不確定度評定，日常評定可只對A 類不確定度進行評定即可。

不同于化學微量檢測的樣品均勻性良好，微生物檢測樣品均勻性差，微生物檢測以宏觀為主、樣品代表性差、微生物分布不均及不同菌落間互生或拮抗等作用給微生物檢測帶來很多不確定性，都為微生物檢測測量不確定度評定帶來困難[17-18]。

研究過程中A 類測量不確定度數據來源為同一樣品同一條件下重復測量所得，雖可用貝塞爾公式直接計算，但日常檢測過程中多為不同樣品，其檢測結果發散性大，建議對不同屬性樣品進行測量不確定度評價，充分考慮樣品種類、性質帶來的差異。

除了提到、計算的不確定度分量外，微生物測量不確定度分量來源還有樣品屬性（樣品性質、均一性）、培養基（品牌、配置時間、滅菌溫度及時間、pH 值）、微生物培養環境（溫度、濕度、時長） 等，這些分量復雜且不易計算，對不確定度影響較小，不予考慮。實驗室在日常檢測過程中需注意這些分量對測量不確定度的影響，建議制訂作業指導書、規程等來規范操作減少此類分量的影響。