高效液相色譜法測(cè)定慕薩萊思中山梨酸鉀的含量

周 環(huán)，王 凱，陳盼盼，楊凱龍，李 璐

（1.塔里木大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

0 引言

慕薩萊思（Musalais），是南疆阿瓦提地區(qū)少數(shù)民族以鮮食葡萄為主要原料發(fā)酵釀制而成的一種酒類飲品，加入枸杞、肉蓯蓉、鴿子、雪雞等輔料，甚至作為烤羊肉等調(diào)味料，形成不同風(fēng)味，不但酒精度較高，且營養(yǎng)價(jià)值豐富，其中含有大量的黃酮類物質(zhì)，18 種氨基酸及十幾種微量元素和維生素；此外，還含較多的有機(jī)酸（如沒食子酸、肉桂酸等）。對(duì)于提升睡眠質(zhì)量、清除瘀血、緩解失眠癥狀等癥狀具有一定的功效[1]。如今，慕薩萊思規(guī)模化生產(chǎn)步入發(fā)展階段，逐步從家庭作坊式生產(chǎn)向現(xiàn)代化工廠化生產(chǎn)轉(zhuǎn)變，并于2019 年4 月正式加入《新疆維吾爾自治區(qū)葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2019—2025 年）》，目前阿瓦提縣釀造慕薩萊思家庭式作坊400 多家，大型生產(chǎn)工廠10 余家，年產(chǎn)量達(dá)5 000 t 以上[2]，在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)由于其糖漿及成品保藏期較短，易腐敗變質(zhì)。因此，在其生產(chǎn)過程中會(huì)加入山梨酸鉀作為防腐劑，添加量受到生產(chǎn)者及消費(fèi)者的關(guān)注，準(zhǔn)確檢測(cè)穆薩萊思中山梨酸含量是確保產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵，只有具有準(zhǔn)確檢測(cè)的方法手段，才能使得這一民族特色產(chǎn)品在新時(shí)代中發(fā)展更迅速。

山梨酸鉀（Potassium Sorbate），也稱為2,4 - 己二烯酸鉀，是山梨酸的鉀鹽，是目前最常見的食品防腐劑之一，其作用機(jī)制是通過與侵入微生物系統(tǒng)的巰基結(jié)合而破壞微生物體的許多酶[3]，使得微生物酶失活，達(dá)到防腐延長貨架期的目的。因低毒性，所以目前被廣泛使用。聯(lián)合國糧農(nóng)組織將山梨酸鉀現(xiàn)推薦為安全、高效的食品防腐劑，許多發(fā)達(dá)國家已經(jīng)把山梨酸鉀作為良好、高效的防腐劑，大量地應(yīng)用于食品中[4]。食品中山梨酸鉀的測(cè)定方法多樣，目前在試驗(yàn)中使用較多的分別為熒光檢測(cè)法[5-7]、紫外光譜法[8-9]、拉曼特征峰法[10-11]、氣相色譜法[12-13]、高效液相色譜法[14-17]等。熒光檢測(cè)法顯色靈敏、回收率高，但易受時(shí)間溫度影響[9]；紫外光譜法具有操作便捷、結(jié)果精準(zhǔn)、具有高回收率等優(yōu)點(diǎn)，但專一性較差，最低檢測(cè)濃度較高；高效液相色譜法雖然靈敏度與熒光檢測(cè)法、紫外光譜法相比較低，但是其可以對(duì)樣品進(jìn)行前處理，通過凈化和富集作用來增加靈敏度，具有專一性強(qiáng)、檢測(cè)限低、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)[15]。近年來，利用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)食品、藥品中的化學(xué)成分已較為普遍，田莉等人[16]建立了HPLC 法測(cè)定發(fā)酵面制品中山梨酸含量的方法，試驗(yàn)成功優(yōu)化了提取方法、方法適用等方面的內(nèi)容。李岳等人[18]通過HPLC 法測(cè)定小兒咳喘靈口服液中山梨酸鉀的含量試驗(yàn)，結(jié)果表明，山梨酸鉀濃度在一定范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系（R=0.999 9），平均回收率可達(dá)到100.0%，RSD 為0.47%（n=9），線性濃度范圍內(nèi)與峰面積關(guān)系良好。截止到目前，研究者采用HPLC 對(duì)食品中山梨酸鉀檢測(cè)的研究，主要集中在檢測(cè)藥品[19-20]、面制品[21-22]、調(diào)味品[23-24]、果汁[25]、部分酒類[26-27]。首次提出利用HPLC 法建立慕薩萊思中山梨酸鉀的測(cè)定方法，該方法建立優(yōu)化成功后不僅對(duì)慕薩萊思中山梨酸鉀檢測(cè)方法有一定指導(dǎo)意義，有利于填補(bǔ)慕薩萊思檢測(cè)方面的空白，為其產(chǎn)品規(guī)范化奠定一定試驗(yàn)基礎(chǔ)，也對(duì)其中其他物質(zhì)含量檢測(cè)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料與儀器

慕薩萊思樣品，新疆阿瓦提縣慕薩萊思生產(chǎn)企業(yè)提供；山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥99.99%），阿拉丁試劑（上海） 有限公司提供；氨水、乙酸銨、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純?cè)噭瑖幖瘓F(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；甲醇為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供。

LC-20A 型液相色譜儀、SPD-M20A 型檢測(cè)器，日本島津公司產(chǎn)品；KQ- 100VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；LE203E/0 型電子天平，梅特勒- 托利多儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液制備

（1） 氨水溶液。取氨水1 mL，加到99 mL 水中，混勻。

（2） 乙酸銨溶液。稱取乙酸銨1.54 g，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL，即得濃度為20 mmol/L的乙酸銨溶液，然后經(jīng)0.22 μm 水相微孔濾膜過濾后備用。

1.2.2 樣品處理

樣品處理依據(jù)GB 5009.28—2016 中處理方法，并做一定修改。準(zhǔn)確稱取10 g 慕薩萊思，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至25 mL，過0.22 μm 針式濾膜備用。

1.2.3 標(biāo)品制備

（1） 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取山梨酸鉀和苯甲酸鈉0.134 g 和0.118 g，用水溶解并分別定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)貯備液。使用山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，需要用甲醇溶解并定容。

（2） 山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。準(zhǔn)確吸取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各10.0 mL 于50 mL 容量瓶中，用水定容，即得質(zhì)量濃度為200 mg/L 山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于4 ℃條件下貯存。

（3） 山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。準(zhǔn)確吸取山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0，0.05，0.25，0.50，1.00，2.50，5.00，10.00 mL，用水定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，臨用現(xiàn)配。

1.2.4 色譜條件

參照GB 5009.28—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》第一法液相色譜法[28]，并作一定修改。色譜柱：X bridge C18（250 mm×4.6 mm，i.d.） 柱（美國Waters）；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為0.02 mol/L 乙酸銨，等度洗脫，流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

每個(gè)處理重復(fù)3 次，結(jié)果以X±SD 表示，采用IBM SPSS Statistics 20.0 進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan's 多重比較（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

分別用X bridge C18（250 mm×4.6 mm，i.d.） 柱（美國Waters） 和Spursil C18（250 mm×4.6 mm，i.d.）柱（天津迪馬） 兩款C18色譜柱分析，獲得山梨酸鉀標(biāo)品的HPLC 色譜圖。

2 種C18柱分析山梨酸的色譜峰見圖1。

圖1 2 種C18 柱分析山梨酸的色譜峰

由圖1 可知，2 種色譜柱均能獲得山梨酸的HPLC 色譜圖，但是2 種色譜柱對(duì)山梨酸色譜峰的保留時(shí)間及峰形的影響較大。Spursil C18色譜柱的保留時(shí)間為21.28 min，色譜峰寬且有明顯拖尾，而X bridge C18色譜柱的保留時(shí)間僅為12.85 min，且色譜峰窄，峰形尖銳，說明X bridge C18色譜柱更適合于山梨酸的HPLC 分析。

2.2 有機(jī)相比例的優(yōu)化

為確認(rèn)有機(jī)相對(duì)山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品的影響，參照GB 5009.28—2016 中的液相色譜條件，用X bridge C18（250 mm×4.6 mm，i.d.） 柱進(jìn)行分析，改變A 相（甲醇） 的比例，獲得了山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品和慕薩萊思的HPLC 色譜圖。

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品在不同有機(jī)相比例下的色譜圖見圖2，慕薩萊思在不同有機(jī)相比例下的色譜圖見圖3。

圖2 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品在不同有機(jī)相比例下的色譜圖

圖3 慕薩萊思在不同有機(jī)相比例下的色譜圖

由圖2 和圖3 可知，A 相（甲醇） 比例對(duì)色譜圖中山梨酸的保留時(shí)間及峰形均具有較大影響。甲醇比例越大，山梨酸出峰時(shí)間越短，且峰形越尖銳，越有利于山梨酸的準(zhǔn)確定量分析。由圖3 可知，隨著有機(jī)相比例的增加，慕薩萊思中山梨酸色譜峰保留時(shí)間縮短，然而當(dāng)有機(jī)相比例為20%時(shí)，山梨酸色譜峰的基線不平，說明有機(jī)相比例增加，易引起色譜圖基線波動(dòng)，導(dǎo)致山梨酸色譜峰基線不穩(wěn)，不利于山梨酸的準(zhǔn)確定量。因此，慕薩萊思中山梨酸的分析應(yīng)以15%的A 相（甲醇），在該條件下山梨酸的保留時(shí)間短，且基線平穩(wěn)。

2.3 氨水用量對(duì)山梨酸峰面積的影響

氨水作為樣品前處理中重要添加試劑，其影響因素不可小覷。首先按體積比1∶1 的比例配制氨水溶液，然后移取10 mL 慕薩萊思至容量瓶中，分別加入0，0.12，0.50，1.00，2.00，3.00 mL 氨水溶液，混勻后定容，過0.22 μm 針式濾頭，然后進(jìn)行HPLC分析，記錄山梨酸的峰面積。

氨水用量對(duì)山梨酸鉀的峰面積的影響見表1。

表1 氨水用量對(duì)山梨酸鉀的峰面積的影響

盡管參照GB 5009.28—2016 的樣品處理需要添加氨水調(diào)節(jié)pH 值，但由表1 可知，慕薩萊思中添加氨水，對(duì)山梨酸峰鉀面積影響差異不顯著（p＞0.05），說明在慕薩萊思中山梨酸含量分析時(shí)，可以不添加氨水，稀釋后可以直接進(jìn)行液相分析。

2.4 精密性試驗(yàn)

移取10 mL 慕薩萊思至25 mL 容量瓶，用蒸餾水定容，然后過0.22 μm 針式濾頭，再進(jìn)行HPLC分析，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄樣品中山梨酸鉀的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）。

精密性試驗(yàn)見表2。

表2 精密性試驗(yàn)

由表2 可知，重復(fù)進(jìn)樣6 次后所得標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為11 828.79，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD） 為1.12%，該方法測(cè)量山梨酸鉀精密度良好，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，可信度高。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)備相同的慕薩萊思6 份，分別移取10 mL 慕薩萊思至25 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，然后過0.22 μm 針式濾頭備用，分別在室溫條件下放置0，12，24，48，72，96 h 再進(jìn)行HPLC 分析，記錄樣品中山梨酸鉀的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表3 可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD） 為2.23%，放置時(shí)間對(duì)慕薩萊思樣品中山梨酸鉀含量影響很小，排除掉放置時(shí)間對(duì)慕薩萊思中山梨酸鉀含量的影響。

2.6 回收率試驗(yàn)

首先稱取100 mg 山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容至100 mL，獲得質(zhì)量濃度為1 mg/mL 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確移取10 mL 的慕薩萊思樣品至25 mL容量瓶中，添加一定體積山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后用蒸餾水定容，然后過0.22 μm 針式濾頭，再進(jìn)行HPLC 分析，根據(jù)峰面積計(jì)算樣品中山梨酸的含量。

山梨酸的回收率見表4。

表4 山梨酸的回收率

由表4 可知，其加標(biāo)回收率高達(dá)94.11%，表明其測(cè)定慕薩萊思中山梨酸鉀方法準(zhǔn)確度較高，試驗(yàn)可信度良好。

2.7 山梨酸的液相色譜圖

對(duì)上述慕薩萊思樣品及山梨酸標(biāo)品進(jìn)行高效液相色譜分析，得其色譜圖。

山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品和慕薩萊思的HPLC 色譜圖見圖4，山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長見圖5。

圖4 山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品和慕薩萊思的HPLC 色譜圖

圖5 山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長

由圖4 可知，山梨酸鉀的保留時(shí)間為8.37 min。在200～400 nm 范圍內(nèi)；由圖5 可知，山梨酸鉀的最大吸收波長為252 nm。

2.8 山梨酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取一定量山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，甲醇溶解定容，配制質(zhì)量濃度約為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)母液，用山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)母液，配制系列質(zhì)量濃度為0.78～50.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照優(yōu)化后的HPLC 色譜條件分析，測(cè)定其峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（μg/mL） 為橫坐標(biāo)，繪制山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線。上述慕薩萊思樣品及山梨酸標(biāo)品進(jìn)行高效液相色譜分析，得其色譜圖。

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。

圖6 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖6 得到線性回歸方程為Y=80 171X+45 678，R2=0.999 9。按照Araujo P 等人[29]的方法計(jì)算，即檢測(cè)限（LOD） 為3×SD/m 和定量限（LOQ） 為10×SD/m，其中SD 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，m 為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。該方法的檢測(cè)限（LOD） 和定量限（QOD） 分別為1.71 μg/mL 和5.70 μg/mL。這說明建立的方法適合慕薩萊思中山梨酸鉀質(zhì)量濃度的測(cè)定。

2.9 慕薩萊思樣品中山梨酸鉀的測(cè)定

移取10 mL 慕薩萊思至25 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，然后過0.22 μm 針式濾頭，再進(jìn)行HPLC分析，用山梨酸鉀峰面積計(jì)算樣品中山梨酸鉀質(zhì)量濃度。

慕薩萊思樣品中山梨酸鉀質(zhì)量濃度見圖7。

圖7 慕薩萊思樣品中山梨酸鉀質(zhì)量濃度

由圖7 可知，所檢測(cè)慕薩萊思樣品中山梨酸鉀質(zhì)量濃度差異很大，據(jù)GB 2760—2014—19《安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，葡萄酒中山梨酸鉀最大使用量為200 mg/kg，而明顯看出D1 略微超此標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過后期對(duì)超標(biāo)樣品糖度及酒精度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)超標(biāo)樣品均為濃縮果汁或葡萄汁原糖漿，為商家發(fā)酵前原料，商家為延長其保存時(shí)間加入過量的山梨酸鉀，使得其保存時(shí)間增加，且高糖度利于后期發(fā)酵，減少經(jīng)濟(jì)損失，在發(fā)酵期間會(huì)進(jìn)行山梨酸鉀濃度降低處理，達(dá)到符合其成品慕薩萊思酒的標(biāo)準(zhǔn)范圍，因此前期樣品中山梨酸鉀量會(huì)有所偏高。綜上所述，樣品中山梨酸含量差異較大，在生產(chǎn)和貯藏慕薩萊思過程中要精準(zhǔn)控制山梨酸鉀的質(zhì)量濃度。

3 結(jié)論

首次成功建立并優(yōu)化了利用高效液相色譜法測(cè)定慕薩萊思中山梨酸鉀質(zhì)量濃度的方法，利用HPLC法測(cè)定慕薩萊思中山梨酸鉀的峰面積和質(zhì)量濃度之間具有良好的線性關(guān)系，測(cè)定結(jié)果具有較高準(zhǔn)確率，且重復(fù)性好、回收率穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便，為監(jiān)測(cè)慕薩萊思中的山梨酸鉀提供了有效的分析方法。