響應面法優化蛋殼膜中硫酸軟骨素提取工藝

劉恒洋，尹玉鑫，郭曉徐，宋紹奇，劉美玉

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038；2.邯鄲市天然產物與功能性食品開發重點室驗室，河北邯鄲 056038）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，禽蛋產品在世界范圍內的消費量也不斷增多，大量廢棄蛋殼隨之產出，從而造成了極大的環境污染和資源浪費[1]，事實上，蛋殼中含有大量可利用資源，其中含有的鈣類物質、活性肽、蛋白質等成分，具有很高的利用價值[2]。近年來，對于廢棄雞蛋殼的研究逐漸加深，人們逐漸重視對此資源的開發與利用[3]，此項研究的開展不但能改善日益嚴重的環境問題，而且變廢為寶，提高了雞蛋的附加值，推動了雞蛋殼深加工產業的發展，可謂一舉兩得。

硫酸軟骨素呈白色粉末，無臭、有引濕性、遇水有粘黏性，廣泛存在于動物組織、細胞表面與細胞基質之間[4]。硫酸軟骨素的用途廣泛，可作為膳食保護劑，起到保護關節等軟骨組織的效果，可以很好地緩解關節不適等癥狀，治療骨關節炎等疾病。同時，硫酸軟骨素具有抗凝血、鎮靜、抗腫瘤、抗氧化、調節血脂等功能，因此硫酸軟骨素被廣泛應用于食品、醫療、化妝品等行業中。近年來，對于硫酸軟骨素的需求量不斷增加[5-7]，以硫酸軟骨素作為研究對象的產品市場前景廣闊。

目前，我國硫酸軟骨素主要提取工藝為從動物軟骨組織中進行提取，通過高溫蒸煮的辦法，使動物結締組織破壞，通過堿解法或酶解法從中進行硫酸軟骨素的提取，也可以通過微生物發酵進行硫酸軟骨素的提取。除此之外，硫酸軟骨素也可以從蛋殼膜中進行提取，相比與從動物軟骨組織中提取，蛋殼膜中提取硫酸軟骨素不僅可以有效地利用我國的蛋殼資源，達到真正意義上的廢物利用，蛋殼膜獲取方式簡單，且原材料產量極大，也能直接增加硫酸軟骨素的產量。目前，從蛋殼中提取硫酸軟骨素的方法很多，常見的方法有堿提取法、堿酶法、堿鹽法。這些工藝提取的硫酸軟骨素，在提取率上相差不大。劉濤等人[8]通過堿鹽法從蛋殼膜中提取硫酸軟骨素，提取率為74%。劉寧等人[9]通過酶提取法硫酸軟骨素，利用木瓜蛋白酶水解蛋殼質的性質，將硫酸軟骨素從糖蛋白中分離出來，從而進行硫酸軟骨素的提取，該工藝的提取率為75.31%，略高于堿鹽法提取率。劉國慶等人[10]利用稀堿法處理蛋殼膜，并通過雙酶法進行提取，采用胰蛋白酶和胃蛋白酶相結合的提取工藝，該工藝下硫酸軟骨素的提取率為76%。對比其他提取工藝，堿鹽法提取硫酸軟骨素工藝相對簡單，且提取率并不低，與酶法提取硫酸軟骨素相比，在提取成本上要大大減少，較適合批量生產使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋殼，收集于河北省邯鄲市美食林工業園；氯化鈉、氯化鈣、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖標品、碳酸鈣、無水碳酸鈉等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司產品；80 目標準分樣篩，浙江上虞市道墟張興紗篩廠產品；搖擺式中藥粉碎機，新昌縣德科機械有限公司產品；電熱鼓風干燥箱，上海博珍儀器設備制造廠產品；高速冷凍離心機，廣東佛衡儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 硫酸軟骨素提取率測定方法

（1） 多糖標準曲線的制作。用電子天平準確稱取標準葡萄糖20 mg，將稱取好的葡萄糖加入到的蒸餾水中，裝入到500 mL 的容量瓶中，用膠頭滴管滴至刻度線，定容搖勻好備用。采用移液槍分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL 的標準溶液至試管中，并用蒸餾水補至2.0 mL。依次加入苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL。另做一個2 mL 的蒸餾水重復上述顯色操作做空白對照試驗；將上述制得結束試管進行搖勻，靜置30 min后，放入紫外分光光度儀中，于波長490 nm 處測得吸光度。以多糖質量濃度作為橫坐標，吸光度作為縱坐標繪制標準曲線。

（2） 硫酸軟骨素含量測定。采用移液槍定量吸取250 μL 待測液體，用蒸餾水補至2 mL，加入1 mL 的苯酚及5 mL 的濃硫酸，并進行充分搖勻，將其靜置30 min，移至紫外分光光度儀中，于波長490 nm 處測其吸光度，將所測得的吸光值，代入標準曲線中，通過換算便可得到硫酸軟骨素的含量。

（3） 硫酸軟骨素提取率的計算。

式中：W——硫酸軟骨素的提取率，%；

C——將待測樣品代入吸光值中測得的多糖含量，g；

V1——定容液體的體積，mL；

V2——測量時所取液體的體積，mL；

M——蛋殼膜中總糖含量，g。

1.3.2 單因素試驗設計

定量稱取1 g 蛋殼膜（精確到0.01 g）。在多組預試驗的基礎上選取料液比、提取溫度、堿鹽比、提取時間4 個因素進行單因素試驗。探究不同因素對蛋殼膜中硫酸軟骨素提取率的影響。先設置料液比為1∶13，反應溫度為50 ℃，堿鹽比為3∶1，反應時間為5 h 作為每個因素除自身外的固定值，再設計料液比、反應溫度、堿鹽比和反應時間。

單因素與水平設計見表1。

表1 單因素與水平設計

1.3.3 響應面試驗設計

根據單因素的試驗結果，設計四因素三水平的響應面試驗，將料液比、反應溫度、堿液濃度、反應時間4 個影響因素較大的因子，利用響應面試驗優化從蛋殼膜中提取透明質酸的最佳工藝參數，以透明質酸的提取量作為參考指標進行分析。

響應面分析因子水平編碼見表2。

表2 響應面分析因子水平編碼

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同料液比對硫酸軟骨素脫鈣率的影響

暫定堿鹽比為3∶1，提取溫度為50 ℃，提取時間為6 h，探究不同料液比對硫酸軟骨素提取率的影響。

料液比對硫酸軟骨素提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對硫酸軟骨素提取率的影響

由圖1 可知，在料液比為1∶13～1∶15 時，隨著料液比的上漲，硫酸軟骨素的提取率也在不斷升高；在料液比為1∶15 時，硫酸軟骨素的提取率達到最高點，此時的提取率為46%，因為隨著料液比的增加，蛋殼膜中的水分也不斷增多，堿試劑與鹽試劑對蛋殼膜的接觸面積增大，從而加速了硫酸軟骨素的提??；料液比為大于1∶15，硫酸軟骨素的提取率趨勢趨于平緩，并無顯著的提升，分析其原因，1∶15 的料液比基本可使蛋殼膜中的硫酸軟骨素的提取進行反應完全，因此料液比為1∶15 之后，再次提高料液比對硫酸軟骨素的提取率影響不大。綜合考慮，選擇最佳料液比為1∶15 即可滿足試驗需要。

2.1.2 不同提取溫度對硫酸軟骨素提取率的影響

固定料液為1∶15，暫定堿鹽比為3∶1，提取時間為6 h，探究不同提取溫度對硫酸軟骨素提取率的影響。

提取溫度對硫酸軟骨素提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對硫酸軟骨素提取率的影響

由圖2 可知，隨著提取溫度從30 ℃升高到60 ℃，硫酸軟骨素的提取率也隨著溫度的升高而增長，在提取溫度為60 ℃時，此時硫酸軟骨素的提取率達到最高，為46.5%。因為隨著溫度的提升，溶液中的反應速率也在加快；提取溫度為60 ℃為最佳反應溫度，此時硫酸軟骨素的提取率最高；提取溫度60 ℃之后，再次升高溫度，硫酸軟骨素的提取率趨于平緩，并略有降低態勢。這是由于過高的提取溫度可能會導致蛋殼膜的性質發生變化，從而不利于硫酸軟骨素的提取。綜合考慮，選擇提取溫度為60 ℃作為蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的最佳溫度。

2.1.3 不同堿鹽比對硫酸軟骨素提取率的影響

固定料液比為1∶15，提取溫度為60 ℃，暫定反應時間為6 h，探究不同堿鹽比對硫酸軟骨素提取率的影響。

堿鹽比對硫酸軟骨素提取率的影響見圖3。

圖3 堿鹽比對硫酸軟骨素提取率的影響

由圖3 可知，隨著堿鹽比的升高，硫酸軟骨素的提取率呈現先升高再降低的趨勢。堿鹽比從4∶1增加到6：1，硫酸軟骨素的提取率逐漸升高，在堿鹽比為6∶1 時硫酸軟骨素提取率達到最高值為53.5%，因為適當的提高堿濃度會促進堿解的迅速進行，加速硫酸軟骨素的提?。划攭A鹽比達到7∶1后，硫酸軟骨素的提取率升高不顯著，且有降低的趨勢，過高的堿鹽比的加入，會對蛋殼膜造成一定程度的破壞，導致蛋殼膜的性質發生變化，從而影響硫酸軟骨素的提取。綜合考慮，選擇堿鹽比6∶1為最佳堿鹽比。

2.1.4 不同提取時間對硫酸軟骨素提取率的影響

固定料液比為1∶15，提取溫度60 ℃，堿鹽比為6∶1，探究不同提取時間對硫酸軟骨素提取率的影響。

提取時間對硫酸軟骨素提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對硫酸軟骨素提取率的影響

由圖4 可知，隨著提取時間的增加，硫酸軟骨素的提取率呈現逐漸增長的趨勢，提取時間從2 h 延長到8 h 的階段，硫酸軟骨素的提取率顯著提高，在提取時間為8 h 時，此時的提取率基本達到最高，為56.5%。分析其原因，適當延長提取時間會使蛋殼膜中的硫酸軟骨素堿解更為完全，因此硫酸軟骨素的含量也是顯著提升，8 h 基本上可以使其完全提取，此時延長反應時間對硫酸軟骨素的提取率影響不大，且過長的提取時間有可能會造成微生物的污染，且造成試驗時間的浪費。綜合考慮，確定提取時間為8 h 為硫酸軟骨素的最佳提取時間。

2.2 響應面試驗結果分析

在單因素試驗結果的基礎上，利用Design Expert 10.0.8 響應面軟件設計Box-behnken 試驗，測定硫酸軟骨素提取率（Y）。

響應面試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果

根據單因素的試驗結果，選取料液比（A），提取溫度（B），堿鹽比（C），提取時間（D） 作為響應因素，篩選蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的最佳工藝條件，利用響應面法對其進行優化試驗，采用Design Expert 10 設計四因素三水平的響應面試驗。試驗結果對蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的數據進行多元回歸擬合，結果表明各因素與響應面的二次多項回歸模型為：

根據p 值大小進行判斷是否顯著，當p＜0.05 為顯著，p＜0.01 為極顯著。

響應面試驗結果方差分析見表4。

表4 響應面試驗結果方差分析

由表4 可知，蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的提取率為響應值時，該模型p＜0.01，表示該二次項方程為極顯著；失擬項p=0.145 4＞0.05，模型失擬項不顯著，失擬項不顯著表示該二次項模型擬合較好，模型決定系數R2為0.984 3，表示該二次項模型可以解釋98.43%的試驗數據，試驗擬合較好，且誤差較小，R2Adj為0.968 6，兩者數值較高，且較為接近，表明模型有較好的使用性和通用性，該模型可以很好地反映響應值硫酸軟骨素提取量的變化，可采用該模型對蛋殼膜膜中提取硫酸骨素進行實際分析；通過變異（CV） 可以反映出模型的可信度，變異系數的值越低，表示模型的可信度越高，該試驗的變異系數為1.58%，表示該模型較為可信。各因素對蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的影響由高到低分別是A＞D＞C＞B，即料液比＞提取時間＞堿鹽比＞提取溫度。

各因素交互作用的響應面與等高線圖見圖5。

由圖5 響應面3D 圖可直觀描述回歸模型，等高線圖形越趨近與圓形表示2 個自變量的交互作用越弱，等高線越趨近與橢圓形表示2 個變量的交互作用越強。各個因素之間的交互作用對蛋殼膜中提取硫酸軟骨素影響強弱排序為AC＞CD＞BC＞AB＞BD＞AD，即料液比與堿鹽比之間的交互作用＞堿鹽比與提取時間之間的交互作用＞提取溫度與堿鹽比之間的交互作用＞料液比與提取溫度之間的交互作用＞提取溫度與提取時間之間的交互作用＞料液比與提取時間之間的交互作用。相對而言，試驗中料液比（A） 與堿鹽比（C） 交互作用曲面最為陡峭，表明在提取硫酸軟骨素試驗中，料液比的增加對堿鹽比的影響顯著（p＜0.01）。AC 的交互作用達到極顯著水平（p＜0.01），CD 的交互影響達到顯著水平（p＜0.05）。

由回歸模型預測和分析得出蛋殼膜中提取硫酸軟骨素最佳工藝為料液比1∶15.408，提取溫度59.476 ℃，堿鹽比6.014∶1，提取時間8.146 h，此時的硫酸軟骨素的提取率可達76.67%。

2.3 驗證試驗

考慮到實際情況，粗蛋殼膜為1 g 時，選取料液比為1∶15.5，提取溫度為60 ℃，堿鹽比為6∶1，提取時間為8 h，在此條件下，硫酸軟骨素的提取率可達76.5%，理論值與實際值相差不大，擬合較好，相對誤差＜0.5%，該驗證試驗結果表明采用此響應面法得到的工藝參數真實可信。

3 結論

以蛋殼膜為原材料，采用堿鹽法進行提取蛋殼膜中的硫酸軟骨素，在單因素試驗的基礎上設計四因素三水平的響應面試驗，優化提取硫酸軟骨素的工藝參數，以硫酸軟骨素的提取量作為指標，以苯酚硫酸法作為檢測方法，從而得到蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的最佳工藝為蛋殼膜1 g，料液比1∶15.5，提取溫度60 ℃，堿鹽比6∶1，提取時間8 h，在最佳工藝的條件下提取硫酸軟骨素，提取率可達76.5%。該試驗為蛋殼膜的綜合利用提供了有效參考，為工業化生產提供了試驗數據。