地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌對銀杏葉發酵的初步研究

陳建榮，陳錦靈

（1.韶關學院 生物與農業學院，廣東 韶關 512005；2.南昌大學 瑪麗女王學院，江西 南昌 330031）

銀杏（Ginkgo bilobaL.）是中國特有而豐富的經濟植物，適應性強，有較高的觀賞價值和經濟價值. 銀杏富含黃酮類化合物和萜類化合物，富含多糖、氨基酸、多種微量元素等成分，臨床應用價值較高，具藥用、保健、食用、材用、觀賞于一體［1］. 銀杏葉含有有機酸類、黃酮類、萜內酯類、酚類、烷基酚酸類、醇類物質以及甾類等各種化學活性成分高達160 余種. 用銀杏葉制作的飼料添加劑符合國家要求，銀杏葉提取物具有顯著的免疫調節功能和抗氧化應激能力，能抑制多種病原微生物，提高動物的生長性能［2］. 但銀杏葉提取物的價格昂貴，使銀杏葉在應用中受到限制，但直接利用銀杏葉作為飼料添加劑，其適口性差，葉中的纖維素、半纖維素等難以被禽類利用［3-4］.

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種相對比較常見的革蘭氏陽性細菌，能產生多種活性酶，如蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶等，具有降解食物中碳水化合物的作用［5-7］. 納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）是嗜氧菌，能生成多種蛋白酶（特別是堿性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性飼料中某些復雜的碳水化合物，從而提高飼料的轉化率［8-10］.兩種菌均是綠色安全無污染的飼料添加劑.

研究地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌發酵銀杏葉，改善銀杏葉飼喂的適口性和營養成分，可以有效利用銀杏葉來促進雞的生長和提高雞的防病治病能力［2］. 此研究既符合國家產業政策和投資方向，又能促進地方經濟發展，具有明顯的經濟效益、生態效益和社會效益.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試驗材料

銀杏葉（韶關銀杏樹種植區）；地衣芽孢桿菌活菌顆粒（東北制藥集團沈陽第一制藥廠，活菌數109cfu·g-1）；納豆芽孢桿菌（廣州農冠生物科技有限公司，活菌數0.5×109cfu·g-1）.

1.1.2 培養基

肉膏蛋白胨瓊脂（NA）培養基，淀粉培養基，活化斜面培養基，種子培養基（3.0%葡萄糖+4.0%蛋白胨+0.5 % NaCl+ 0.5 %牛肉膏+ 0.5 %酵母膏），液體發酵培養基（100 mL 豆漿+2.0 %葡萄糖+0.5 % NaCl+2 % NaOH）.

1.2 方法

1.2.1 地衣芽孢桿菌培養

取0.25 g 地衣芽孢桿菌活菌顆粒溶于2.25 mL 無菌水中，震蕩5 min，然后進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度稀釋. 在低溫無菌培養環境下，用高壓滅菌后的移液管取0.1 mL 的10-5、10-6、10-7倍稀釋液滴于無菌牛肉膏蛋白胨培養基中，用經過高壓鍋滅菌的消毒涂布器在無菌培養基上均勻涂抹，然后在37 ℃恒溫箱中倒置無菌培養48 h 后，仔細觀察3 個不同濃度下菌落，就其正常形態、生長發育變化情況等進行記錄，選擇生長較好、形態比較完整的菌落來發酵銀杏葉.

1.2.2 納豆芽孢桿菌的培養

納豆菌制備：用接種環挑取少量納豆表面的黏性物質，并移至裝10 mL 無菌水的試管中充分攪拌，制成懸濁液. 取少量懸濁液，在活化斜面培養基平板上涂劃線，置35 ℃培養箱中恒溫培養24～48 h 后，挑取少量平板上長出的有拉絲的菌落，鏡檢觀察為納豆菌. 繼續劃線純化2～3 次，挑取單菌落，于種子培養基中保存.

菌懸液制備：從斜面上挑取幾環菌種接入裝有70 mL液體發酵培養基的三角瓶中，于35 ℃，100 r·min-1搖床振蕩培養16～24 h 的種子菌懸液，待用.

納豆菌擴大培養：將制得的種子菌懸液以4%～6%的接種量接于液體發酵培養基中，在35 ℃，pH 7.0條件下培養24 h.

1.2.3 銀杏葉發酵

將干燥銀杏葉用粉碎機粉碎后進行高壓滅菌，分別將地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌接種環挑出菌落，接入含37 ℃的20.8%葡萄糖溶液的燒杯中，攪拌，活化30 min，加入銀杏葉100 g、硫酸銨10.4 g、維生素0.416 g、硫酸鉀0.416 g，混合均勻，補充37 ℃溫水至200 mL，用呼吸膜包裝密封，放入恒溫箱，在35～37 ℃下發酵5 d.記錄發酵前后銀杏葉的顏色和氣味，并測定發酵前后的pH 值、細菌總數、粗纖維、粗蛋白等.

1.2.4 檢測方法

pH 值：GB 5009.239—2016 食品安全國家標準 食品酸度的測定［11］；

細菌總數：GB/T 13093—2006 飼料中細菌總數的測定［12］；

粗纖維：GB/T 6434—2022 飼料中粗纖維的含量測定［13］；

粗蛋白：GB/T 6432—2018 飼料中粗蛋白的測定［14］.

2 結果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌發酵效果評價

從表1 可知，地衣芽孢桿菌發酵銀杏葉后，細菌總數顯著提高，說明地衣芽孢桿菌能很好地在銀杏葉上發酵生長；發酵前，銀杏葉為翠綠色，有抹茶味，發酵后銀杏葉為棕褐色，酸味及茶味濃厚；發酵前pH值為4.8，發酵后為4.0，下降了0.8；發酵使銀杏葉酸性變強，茶味變濃，能在一定程度上促進食欲.

表1 地衣芽孢桿菌發酵銀杏葉的感官及營養成分變化

同時，從表1 還可知，發酵后粗蛋白含量由11.17%提升為20.12%，提升了80.1%，說明地衣芽孢桿菌發酵后，能較大程度提升粗蛋白的含量及利用率；發酵后銀杏葉的總纖維數含量由1.06%下降到0.21%，下降了80.2%，說明通過地衣芽孢桿菌發酵，能較大程度地降解掉銀杏葉中的纖維，進一步改善銀杏葉的飼料適口性.

2.2 納豆芽孢桿菌發酵效果評價

從表2 可知，納豆芽孢桿菌發酵銀杏葉后，細菌總數也有所提高，說明納豆芽孢桿菌能在銀杏葉上發酵生長；納豆芽孢桿菌發酵后，銀杏葉由翠綠色、抹茶味變為棕黃色、淡酸味及淡茶味，pH 值從4.8 降為4.6，降幅不大，但納豆芽孢桿菌發酵銀杏葉也能在一定程度上增進食欲.

表2 納豆芽孢桿菌發酵銀杏葉的感官及營養成分

同時，從表2 還可知，發酵后粗蛋白含量由11.17%提升為15.65%，提升了14.7%，一定程度提升粗蛋白的含量及利用率；發酵后銀杏葉的總纖維數含量由1.06%下降到0.88%，下降了17.0%左右，說明通過地衣芽孢桿菌發酵，能在一定程度上降解銀杏葉中的纖維，一定程度上改善銀杏葉的飼料適口性.

2.3 地衣芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌發酵銀杏葉效果比較

2.3.1 地衣芽孢桿菌發酵后細菌總數、粗蛋白含量都高于納豆芽孢桿菌

地衣芽孢桿菌含有豐富的酶類，如果膠酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶等，這些酶類可以將淀粉、纖維素和蛋白質等分解成小分子糖 、氨基酸 、醇類等易被消化和吸收的低分子物質［7］. 納豆芽孢桿菌能生成多種蛋白酶（特別是堿性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性飼料中某些復雜的碳水化合物等成分［10］. 從表1 和表2 可知，使用2 種菌發酵，都能使銀杏葉中的粗蛋白和細菌總數得到提高，銀杏葉的營養成分得到提高，但地衣芽孢桿菌效果更好.

2.3.2 發酵后總纖維、總黃酮都有所下降

地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌都含有淀粉酶等多種可降解植物纖維素的酶類［7，10］，發酵后的銀杏葉纖維含量都有所下降，特別是地衣芽孢桿菌更能有效地降低纖維含量，提高飼料的適口性.

另外，由于納豆芽孢桿菌好氧，在密閉容器中發酵時發現，發酵效果不理想，因此，綜合考慮，為提升銀杏葉作為飼料的適口性及效果，建議用地衣芽孢桿菌來發酵銀杏葉，不建議用納豆芽孢桿菌來發酵銀杏葉.

3 結論

研究表明，地衣芽孢桿菌發酵能有效提高銀杏葉的細菌總數、粗蛋白含量，降低纖維含量，改善銀杏葉作為飼料的適口性；納豆芽孢桿菌也能一定程度提高銀杏葉的細菌總數、粗蛋白含量并降低纖維含量，改善銀杏葉的適口性，但效果沒有地衣芽孢桿菌明顯；同時納豆芽孢桿菌因好氧，在密閉環境中不能很好地發酵，所以不建議用于銀杏葉的發酵.