基于ceRNA網(wǎng)絡(luò)識別登革熱診斷標志物

鄭德華,許達華,畢小慢,曹 勐,徐智洲,陳荔旸,李 思,魯健平,李孔寧*

(1.海南醫(yī)學院 生物醫(yī)學信息與工程學院 熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學教育部重點實驗室,海口 570099; 2.哈爾濱醫(yī)科大學 生物信息科學與技術(shù)學院,哈爾濱 150076)

登革熱,是登革病毒(Dengue virus, DENV)經(jīng)蚊媒傳播引起的急性傳染病,被認為是最重要的蟲媒傳染病。全世界每年約有3.9億人感染登革熱,波及100多個國家,其中以菲律賓,越南,泰國,馬來西亞等東南亞國家和南美洲的巴西最為嚴重[1]。而我國發(fā)生登革熱爆發(fā)或流行及本地感染病例的地區(qū)有廣東,廣西,海南,浙江等,因此登革熱成為了危害大眾健康的傳染性疾病之一[2]。在目前的研究中,登革病毒的實驗室診斷方法存在著對設(shè)備要求高,操作繁瑣,診斷時間長,精度差等缺點。因此,從分子層面尋找準確高效的登革熱診斷標志物意義重大。

競爭性內(nèi)源RNA(Competing endogenous RNA, ceRNA)網(wǎng)絡(luò)在復(fù)雜疾病的生物學功能中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明,通過比較正常細胞和腎透明細胞癌細胞中的ceRNA網(wǎng)絡(luò)來檢測失調(diào)的ceRNA相互作用,可有助于研究腎透明細胞癌的發(fā)病機制和識別新的生物標志物[3]。此外,也有研究表明ceRNA網(wǎng)絡(luò)失衡以及分子之間的相互調(diào)控在骨關(guān)節(jié)炎中扮演著重要的角色。為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供新的見解[4]。目前登革熱相關(guān)的失調(diào)ceRNA研究卻很少。基因治療是當前研究疾病的熱門,也是未來的疾病治療的趨勢之一,ceRNA的存在可能影響疾病的產(chǎn)生和發(fā)展,并能成為初次確診、預(yù)后評估的標準以及疾病治療的目標。

本研究基于ceRNA調(diào)控機制,結(jié)合登革熱表達數(shù)據(jù),通過構(gòu)建登革熱相關(guān)ceRNA失調(diào)網(wǎng)絡(luò),對網(wǎng)絡(luò)進行模塊挖掘與富集分析,解析模塊性質(zhì),從而發(fā)現(xiàn)其相關(guān)的功能。探究登革熱對ceRNA調(diào)控作用的影響及其相關(guān)機制,為該疾病的診斷與治療提供指導。

1 材料和方法

1.1 材料的獲取與處理

1.1.1 表達譜數(shù)據(jù)的獲取和處理

基因表達芯片數(shù)據(jù)和登革熱外周血樣本數(shù)據(jù)從GEO數(shù)據(jù)庫下載,數(shù)據(jù)編號為GSE51808, GSE96656。通過標準化和離群樣本處理,選擇GSE51808中18例登革熱樣本、19例恢復(fù)期樣本、9例正常對照樣本以及GSE96656中31例登革熱樣本、9例正常對照樣本進行研究。

1.1.2 人類miRNA靶基因數(shù)據(jù)的獲取

StarBase數(shù)據(jù)庫是一個由高通量實驗數(shù)據(jù)CLIP-Seq和mRNA測序數(shù)據(jù)支持的miRNA靶標數(shù)據(jù)庫[5]。本文從 StarBase數(shù)據(jù)庫中得到了人類的miRNA-mRNA數(shù)據(jù),其中包括了423 976條互作對,386個miRNA和13 802個mRNA。

1.1.3 人類免疫相關(guān)基因數(shù)據(jù)的獲取

Immport數(shù)據(jù)庫由四個組件組成：包括私有數(shù)據(jù)、共享數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)分析和資源。用于數(shù)據(jù)存檔,傳播,分析和重復(fù)使用[6]。從中下載2 498個人類相關(guān)的免疫基因。

1.1.4 登革熱相關(guān)病毒蛋白數(shù)據(jù)的獲取

HVPPI數(shù)據(jù)庫是一個綜合了人類宿主—病毒蛋白質(zhì)互作關(guān)系的數(shù)據(jù)庫[7],能夠用于解析復(fù)雜疾病和病毒感染之間的關(guān)系。從其中下載了8 410條登革熱與人類宿主蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系對,標準化后得到2 941個登革熱病毒蛋白基因。

1.1.5 蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)的獲取

STRING數(shù)據(jù)庫是一個蛋白質(zhì)相互作用分析數(shù)據(jù)庫,可用于對目的蛋白質(zhì)進行檢索,并繪制出相關(guān)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(Protein-Protein Interaction,PPI)的綜合網(wǎng)絡(luò)[8]。從其中下載了蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)和注釋信息,結(jié)合HVPPI數(shù)據(jù)庫中登革熱病毒關(guān)聯(lián)的宿主蛋白進行分析。

1.2 實驗方法

1.2.1 差異表達分析

對獲得的登革熱疾病與健康組表達數(shù)據(jù),使用R語言中的limma包進行差異表達分析,選取闕值為|logFC|>2,FDR<0.05。篩選出用于實驗的差異基因,并用pheatmap包繪制差異熱圖,ggplot2包繪制火山圖,以展示每個差異基因在樣本中的表達情況[9]。

1.2.2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

對從StarBase(V2.0)數(shù)據(jù)庫下載的miRNA-mRNA互作數(shù)據(jù)預(yù)處理,經(jīng)過去重及標準化后存入0/1矩陣進行超幾何計算,得到ceRNA關(guān)系對矩陣。篩選FDR<0.05并且共享miRNA數(shù)目大于等于3的ceRNA關(guān)系對,再與差異基因匹配,得到潛在ceRNA關(guān)系對。接著結(jié)合登革熱疾病樣本中的表達數(shù)據(jù)計算潛在ceRNA分子間的皮爾森相關(guān)系數(shù)并選取大于0.7以及FDR<0.05的互作對用于構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)[10-11]。

1.2.3 失調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò)可視化

將獲得的失調(diào)ceRNA互作關(guān)系對投入Cytoscape生成網(wǎng)絡(luò)。并依據(jù)網(wǎng)絡(luò)中基因的差異表達方向?qū)W(wǎng)絡(luò)節(jié)點顏色進行繪制,接著使用Mcode方法進行模塊挖掘,并選定節(jié)點數(shù)大于10的模塊進行下一步分析。

1.2.4 富集分析

使用WebGestalt數(shù)據(jù)庫[12]對篩選出的差異表達基因以及網(wǎng)絡(luò)模塊進行富集分析。

1.2.5 ceRNA網(wǎng)絡(luò)模塊基因與登革熱病毒蛋白互作分析

將HVPPI中的登革熱相關(guān)宿主蛋白質(zhì)映射至STRING數(shù)據(jù)庫的PPI網(wǎng)絡(luò),聯(lián)合ceRNA網(wǎng)絡(luò)模塊中的基因,確定模塊基因與登革熱相關(guān)宿主蛋白的互作關(guān)系,并統(tǒng)計與各個模塊基因直接互作的人類宿主蛋白數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 登革熱差異表達的基因篩選

對登革熱數(shù)據(jù)外周血芯片表達數(shù)據(jù)(GSE51805)中的15例登革熱樣本,28例健康樣本(包含19例恢復(fù)期樣本和9例正常對照樣本)進行差異表達分析,以|logFC|>2,FDR<0.05進行篩選,共識別出251個差異基因,包括175個上調(diào)基因和76個下調(diào)基因(見圖1a和1b)。接著對篩選出的差異表達基因使用WebGestalt數(shù)據(jù)庫進行富集分析,發(fā)現(xiàn)其主要富集在DNA復(fù)制,錯配修復(fù)以及細胞周期等生物學通路中(見圖1c)。

2.2 構(gòu)建登革熱失調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò)

基于miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫及共表達分析識別登革熱相關(guān)失調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò),使用Cytoscape進行可視化(見圖2),網(wǎng)絡(luò)中紅色節(jié)點表示上調(diào)基因,藍色節(jié)點表示下調(diào)基因。其中共有179個節(jié)點,1 607條邊,上調(diào)的基因有143個,下調(diào)的基因有36個。基因表達上調(diào)相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中共有143個節(jié)點,1 493條邊,表達下調(diào)相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中共有36個節(jié)點,114條邊。

圖1 登革熱差異表達分析及富集分析Fig.1 Dengue fever differential expression analysis and enrichment analysis

圖2 登革熱相關(guān)ceRNA失調(diào)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Dengue-associated ceRNA dysregulation network

2.3 失調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò)的模塊挖掘與富集分析

在Cytoscape中利用Mcode插件對網(wǎng)絡(luò)進行模塊挖掘,總共得到9個模塊,選出節(jié)點數(shù)目大于10的4個模塊(見表1)。細胞免疫和體液免疫是人體抵御病毒感染的重要途經(jīng)。本文下載了免疫相關(guān)的基因集合,并對各模塊和免疫基因進行篩選,發(fā)現(xiàn)模塊2中的基因與免疫基因的重合數(shù)目最高,包括FABP5(Fatty acid binding protein 5), C19orf10(Myeloid derived growth factor), TNFRSF17(TNF Receptor superfamily member 17)等(見表1)。因此選擇模塊2展示及后續(xù)分析(見圖3a)。

通過WebGestalt網(wǎng)站對模塊2基因進行富集分析,結(jié)果主要聚集在有絲分裂細胞周期等功能(見圖3b),說明了登革病毒感染人體時會對細胞的活動產(chǎn)生影響,與細胞周期有密切聯(lián)系。

表1 登革熱失調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò)模塊屬性Table 1 Attributes of dengue fever dysregulation ceRNA network module

圖3 登革熱失調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò)模塊展示Fig.3 Exhibitiaon of dengue fever dysregulation ceRNA network module

2.4 ceRNA網(wǎng)絡(luò)模塊的外部數(shù)據(jù)驗證

利用GSE96656的登革熱外部數(shù)據(jù)對ceRNA網(wǎng)絡(luò)模塊表達進行驗證,通過秩和檢驗發(fā)現(xiàn)外部數(shù)據(jù)中ceRNA網(wǎng)絡(luò)模塊基因的表達模式與訓練數(shù)據(jù)集中基本保持一致(P<0.05)。其中KIF2C,CCNB1,DUSP5,PSAT1,RAD51,DEPDC1B,DTL,RACGAP1,GINS1,KIAA0101,OIP5,DONSON,DHFR,C19orf10,FABP5,CENPW基因在感染登革熱的血液樣本中表達顯著上調(diào),表明這些基因具有潛在的登革熱診斷效能(見圖4a,4b)。聯(lián)合HVPPI和STRING數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)ceRNA網(wǎng)絡(luò)模塊基因能夠通過PPI網(wǎng)絡(luò)與登革熱相關(guān)宿主基因直接互作,其中ANP32E互作的登革熱病毒相關(guān)宿主蛋白基因數(shù)量最多。結(jié)果表明登革熱病毒可能通過調(diào)控宿主蛋白基因的互作關(guān)系從而影響模塊基因的表達(見圖4c)。

圖4 模塊2基因在不同數(shù)據(jù)集中的表達模式及互作登革熱病毒基因的數(shù)量展示Fig. 4 Module 2 expression patterns of genes in different data sets and the number of interacting dengue virus genes

3 討 論

使用公共數(shù)據(jù)庫中的登革熱樣本外周血液數(shù)據(jù),通過生物信息學分析,篩選出登革熱差異表達基因并進行功能富集分析,發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制,細胞周期等生物學通路在登革熱患者中顯著失調(diào)。人體細胞被病毒與細菌等成功入侵后,會引起機體免疫系統(tǒng)應(yīng)答能力下降,從而導致免疫系統(tǒng)功能異常[13-15]。因此在構(gòu)建的登革熱相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中篩選出與免疫基因存在交集的網(wǎng)絡(luò)模塊,并且模塊基因同時富集到與細胞周期相關(guān)的通路中。通過對網(wǎng)絡(luò)模塊的基因表達進行外部數(shù)據(jù)驗證,發(fā)現(xiàn)模塊中的大多數(shù)基因在不同的數(shù)據(jù)中表達趨勢相同,表明識別獲得的登革熱診斷標志物具有魯棒性。

已有研究表明,ceRNA網(wǎng)絡(luò)模塊中的差異基因在免疫調(diào)控,細胞周期等生物學過程中發(fā)揮著重要作用,并在癌癥和診斷和治療的研究中有所應(yīng)用。如FABP5能通過參與細胞調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生維持T淋巴細胞的穩(wěn)態(tài)[16]。青蒿琥酯(ART)可能通過抑制FABP5調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路進而影響肝癌細胞的增殖和遷移,FABP5可能作為ART治療肝細胞癌的新靶點基因[17]。FABP5在腎透明細胞癌組織中呈現(xiàn)高表達,且與預(yù)后差相關(guān),有望成為腎透明細胞癌藥物的重要治療靶點[18]。TNFRSF17在正常和惡性漿細胞的表面以及成熟B細胞上持續(xù)表達,并且在骨髓中長壽漿細胞的存活中起重要的作用,同時也是嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CRT-T)的一個熱門靶點[19-20]。

KIF2C則是有絲分裂相關(guān)的重要驅(qū)動蛋白,并且是Wnt/β-catenin通路的直接靶點,是介導Wnt/β-catenin和mTORC1信號串擾的關(guān)鍵因子[21]。GINS1參與了低等真核生物[22]和人類的DNA復(fù)制過程[23]。GINS1也是肝細胞癌,肺腺癌,腎透明細胞癌的診斷和預(yù)后的生物標志物[24]。PSAT1基因沉默可以使非小細胞肺癌細胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1降解,細胞分裂被阻滯于G0/G1期,最終抑制細胞增殖[25]。目前關(guān)于本研究中篩選出的差異基因和登革熱之間的關(guān)系還鮮有報道,通過HVPPI和STRING數(shù)據(jù)庫互作分析發(fā)現(xiàn)ceRNA網(wǎng)絡(luò)模塊基因能夠與登革熱相關(guān)宿主蛋白直接互作,并且表達模式在不同登革熱數(shù)據(jù)集中基本一致,說明其在登革熱疾病診斷中具有潛在價值。

4 結(jié) 論

本研究解析登革熱相關(guān)基因差異表達模式,并構(gòu)建了登革熱失調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò),通過模塊挖掘識別與登革熱診斷關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)模塊,為尋找登革熱診斷標志物提供了新思路。