花生蛋白鈣螯合肽的制備、富集及表征

張春芝, 王明清, 黃國清, 肖軍霞

(青島農業大學食品科學與工程學院1,青島 266109)

(山東省花生研究所2,青島 266109)

鈣是機體內一種重要的營養素,對維持機體的健康起著無法替代的作用,其與細胞代謝、神經傳導、骨骼生長、肌肉收縮和心臟功能密切相關[1]。當鈣攝入量不足時可導致諸多疾病,如骨質疏松、骨折、退行性骨病、兒童佝僂病及高血壓、結腸癌、肥胖癥和腎結石等[2,3]。飲食攝入是機體補充骨骼中鈣儲存的唯一來源[4]。目前市場上已有多種補鈣產品,其中以無機(如碳酸鈣)和有機鈣(如葡萄糖酸鈣)為主,這些產品在胃酸中釋放出游離的鈣離子,后者在堿性腸道條件下形成不溶性氫氧化鈣,從而導致鈣吸收困難[5];此外,氫氧化鈣會附著在腸壁表面,進而對其他營養素的吸收造成不利影響[6]。氨基酸螯合鈣克服了上述鈣補充劑的缺點,但是其成本較高且有引起脂肪氧化的傾向,這在一定程度上限制了其應用[7]。肽鈣螯合物具有獨特的吸收轉運機制,能夠顯著提高機體對鈣的吸收,同時多肽還可以提高其他礦物元素的生物利用度,因此肽鈣螯合物是一種有潛力的新型鈣補充劑。目前已從多種不同來源的蛋白質中制備得到了鈣螯合肽,如酪蛋白磷酸肽、太平洋鱈魚骨膠原肽、大豆肽等[7]。已有學者從多肽分子質量、氨基酸組成及與鈣離子的螯合方式等角度初步揭示了鈣螯合肽的構效關系[8],并對其體內吸收途徑及生物利用度進行了一定研究[9,10],這為新型肽鈣螯合物的開發及其在食品工業中的應用提供了參考。

花生是全世界及我國的重要農作物,其總產量的54%用于榨油。由于高溫壓榨使花生蛋白發生變性導致其功能性質較差,榨油后的花生餅粕并未得到充分利用,這造成了較嚴重的資源浪費[11]。花生蛋白氨基酸種類齊全,必需氨基酸質量分數高達38.29%,生物活性肽是花生蛋白重要的綜合利用途徑之一,已從花生蛋白成功制備了具有降血壓[12]、抗氧化[13]、抗菌[14]等多種生理功能的多肽水解物。

以花生蛋白為原料來制備鈣螯合肽的研究已有少量報道。馮文君[15]用蛋白酶M(protease M)對花生蛋白進行單酶水解,然后再用谷氨酰胺酶進行脫酰胺處理,得到了鈣結合能力為110.8 mg/g 的花生多肽;在此基礎上,又對花生蛋白水解物進行超濾,得到了鈣結合能力達(124.70±0.80)mg/g的級分,該級分可以有效提高鈣在骨骼中的積累[9],并促進鈣離子在Caco-2細胞中的轉運且不會影響細胞的通透性[10]。

花生肽與鈣離子形成的螯合物具有顯著的生理功能,但是其鈣結合能力仍然有提升的空間。本實驗以花生蛋白為原料,通過多酶水解的方式來進一步提高花生蛋白的水解度和花生肽的鈣結合能力,利用大孔樹脂吸附對鈣螯合肽進行富集,并對所得鈣肽螯合物的性質進行表征,以期為花生蛋白的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生蛋白粉(山東,蛋白質質量分數47%);Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶(2.4 AU/g)、Neutrase 0.8 L中性蛋白酶(600 U/mg)、Protamex復合蛋白酶(1.5 AU/g)、FlavourzymeTM蛋白酶(1 000 LAPU/g)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、酸性蛋白酶(800 U/mg)、Corolase?LAP外切蛋白酶(350 LAP/g)、ProteAXH肽酶(1 400 U/g);大孔樹脂D101、ADS-7、AB-8、DM301、XAD-2,離子交換樹脂IRA900C1、IRC76RCF,其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Nano ZS90納米粒度及zeta電位分析儀,F2700熒光分光光度計,Chiransan圓二光譜儀,NicoletIR200傅里葉變換紅外光譜儀,SHA-B水浴恒溫振蕩器,UV-1200紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶的篩選

按酶底比0.05%(質量分數)分別將Alcalase 2.4 L、Neutrase、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、Protamex和FlavourzymeTM加入裝有100 mL質量濃度為2 mg/100 mL的花生蛋白懸浮液的三角瓶中,然后在各自推薦的最適條件下(詳見表1)在水浴中振蕩4 h。反應結束后,100 ℃沸水浴滅酶10 min,然后在8 000 g下離心15 min,取上清液凍干,測定水解度、氮回收率及鈣結合能力。

表1 8種市售蛋白酶的推薦最適反應條件

1.3.2 復合蛋白酶體系的篩選

按酶底比0.05%(質量分數)將Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶加入裝有100 mL質量濃度為2 mg/100 mL的花生蛋白懸浮液的三角瓶中,然后在其推薦的最適條件下(見表1)水浴中振蕩4 h;反應結束后,用0.1 mol/L NaOH或HCl溶液調節到合適的pH值,再按照酶底比0.05%(質量分數)分別加入ProteAXH肽酶、木瓜蛋白酶、Protamex復合蛋白酶或Corolase?LAP外切蛋白酶,按照表1的最適條件繼續水解4 h。反應結束后,100 ℃沸水浴滅酶10 min,然后在8 000 g下離心15 min,取上清液凍干,測定水解度、氮回收率及鈣結合能力。

1.3.3 花生肽脫酰胺

采用酸化法對花生肽進行脫酰胺處理[16]。準確稱取花生肽凍干粉溶于0.4 mol/L的鹽酸中使其質量濃度達到3 mg/100 mL,密封后于90 ℃下反應4 h。反應結束后,用NaOH調節其pH至7.0,利用分子截留量為100 u的透析袋在去離子水中透析以除去鹽份,冷凍干燥后測定其鈣結合能力。

1.3.4 花生肽鈣螯合物制備條件的優化

以CaCl2為鈣離子來源,采用單因素實驗設計對花生肽鈣螯合物的制備工藝進行優化。向質量濃度為3 mg/100 mL的脫酰胺花生肽溶液中加入CaCl2,使多肽與鈣離子的質量比達到1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1,用0.1 mol/L HCl調節pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,然后在30、40、50、60、70 ℃下靜置20、40、60 、80、100、120 min,使花生肽與鈣離子發生螯合作用。反應結束后,向體系中加入5倍體積的無水乙醇,8 000 g下離心15 min,收集沉淀即得花生肽鈣螯合物,冷凍干燥后備用。

1.3.5 花生鈣螯合肽富集條件的優化

1.3.5.1 大孔樹脂的篩選

稱取處理好的D101、AB-8、DM301、XAD-2、ADS-7、IRA900C1、IRC76RCF樹脂各10 g,分別放入200 mL具塞錐形瓶中,隨后分別加入50 mL質量濃度為20 mg/mL的脫酰胺花生肽溶液,置于30 ℃恒溫搖床中150 r/min振蕩12 h,然后抽濾收集濾液,測定剩余多肽的鈣結合能力及損失率。

1.3.5.2 大孔樹脂吸附富集工藝優化

稱取處理好的最優樹脂10 g,放入200 mL具塞錐形瓶中,按照大孔樹脂與多肽質量比5∶1、7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1加入脫酰胺花生肽溶液,調節其pH值至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,在25、30、35、40、45、50 ℃下反應3、6、9、12、18 h,然后抽濾收集濾液,測定其鈣結合能力。

1.3.6 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的表征

1.3.6.1 粒徑及ζ電位分析

將經過樹脂富集的脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的凍干粉溶解于去離子水中,在25 ℃條件下利用Nano ZS90納米粒度及zeta電位分析儀測定其ζ電位和粒徑。

1.3.6.2 熒光光譜分析

將經過樹脂富集的脫酰胺花生肽溶于去離子水中使其質量濃度達到0.2 mg/mL,再加入一定體積的1 mol/L CaCl2溶液,使反應體系中的Ca2+濃度達到0、5、10、15、20、25 μmol/L,根據1.3.4確定的花生肽與鈣螯合的最適條件進行反應。反應結束后立即進行熒光光譜掃描,激發波長設置為280 nm,發射波長設置為為290～500 nm,發射光與激發光縫寬均設為10 nm[17]。

1.3.6.3 圓二色譜分析

將經過樹脂富集的脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的凍干粉溶解于去離子水中,使其質量濃度達到0.1 mg/mL,于190～260 nm 的波長范圍內進行圓二色光譜掃描,掃描速率為 100 nm/min,掃描間隔為 0.5 nm,以去離子水作為空白,每個樣品重復掃描3次。

1.3.6.4 傅里葉紅外光譜分析

取1 mg將經過樹脂富集的脫酰胺花生肽及其鈣螯合物凍干粉與100 mg KBr混合均勻,壓片后進行紅外光譜分析,掃描范圍為4 000～400 cm-1,儀器分辨率為4 cm-1,掃描次數為64。

1.3.7 水解度及蛋白質回收率的測定

采茚三酮法測定花生蛋白的水解度(DH),其水解度計算公式為[18]:

式中:h為水解液中每克蛋白被裂解的肽鍵數;htot為每克花生蛋白質中的總肽鍵數/mmol/g,其值為7.13 mmol/g[19]。

通過凱氏定氮法測定反應體系中花生蛋白的蛋白質含量(m1)及水解結束后離心上清液中的蛋白質含量(m2),通過公式計算蛋白質回收率(Pr):

1.3.8 鈣結合能力測定

采用EDTA配位滴定法測定鈣離子含量[20]。將10 mg花生肽鈣螯合物溶解于去離子水中,定容至25 mL,加入1 mL掩蔽劑三乙醇胺并滴用KOH調節pH至12.0,加入3滴鈣紅指示劑,搖勻后用EDTA標準溶液滴定,直至指示劑由紫紅色變藍色。記錄消耗體積,按公式計算花生肽的鈣結合能力:

式中:C為EDTA標準溶液濃度/mol/L;V為滴定螯合物所消耗的EDTA標準溶液體積/L;V0為滴定空白所消耗的EDTA標準溶液的體積/L;M為鈣的摩爾質量/g/mol;m為肽鈣螯合物的質量/g。

1.4 統計分析

所有實驗數據均至少有3個重復,結果以平均值±標準差的形式表示。采用SPSS 16.0進行統計分析,組間差異采用方差分析(ANOVA)中的Tukey HSD 測試,當P<0.05 時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 花生蛋白酶解工藝的優化

2.1.1 蛋白酶種類的影響

由圖1可知,蛋白酶種類對花生蛋白的水解度和氮回收率以及水解產物的鈣結合能力有重要影響,其中Alcalase 2.4 L的效果最好,木瓜蛋白酶次之,酸性蛋白酶效果最差。同時,Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶對花生蛋白的水解度也遠高于最適pH值為3.0的蛋白酶M(16.7%)[15],這是由于花生蛋白在堿性條件下可溶,因此能夠與堿性蛋白酶充分接觸而使得水解更為充分。這一超高的蛋白質回收率和水解度對于花生蛋白的綜合利用具有重要意義,Ge等[21]也采用這一策略顯著提高了玉米蛋白粉水解物的蛋白質回收率。同時,由圖1還可以看出,花生蛋白水解物的鈣結合能力與花生蛋白的水解度之間呈正相關,表明花生多肽可能主要通過其羧基與鈣離子結合[7]。

注:1為花生蛋白;2為Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶;3為Neutrase 0.8 L中性蛋白酶;4為酸性蛋白酶;5為FlavourzymeTM蛋白酶;6為Protamex復合蛋白酶;7為木瓜蛋白酶。同一系列數據帶不同字母表示差異顯著,下同。圖1 蛋白酶種類對花生蛋白水解度、蛋白質回收率及水解物鈣結合能力的影響

2.1.2 雙酶復合水解的影響

由于Alcalase 2.4 L對花生蛋白的水解能力及所得水解產物的鈣結合能力均最強(圖1),本實驗將Alcalase 2.4 L與另外幾種蛋白酶,包括木瓜蛋白酶、Protamex復合蛋白酶以及Corolase?LAP外切蛋白酶、ProteAXH肽酶進行復配,以期進一步提高花生蛋白的水解效果。由圖2可知,雙酶復合水解可以顯著提高花生蛋白的水解效果以及水解物的鈣結合能力,其中與ProteAXH肽酶復配時效果最好,花生蛋白的水解度、蛋白質回收率及水解產物的鈣結合能力分別達到了32.19%、87.89%和84.09 mg/g,與Alcalase 2.4 L單酶水解時分別增加了70.95%、6.84%和26.98%。目前已知的對花生蛋白水解能力最強的是來自于黑曲霉HN 3.042(AspergillusnigerHN 3.042)的蛋白酶提取物,其水解度高達43.4%,但是蛋白質回收率為86.6%[22],與本實驗相當;另外,本實驗利用雙酶水解法得到的花生肽的鈣結合能力與用蛋白酶M水解得到的花生蛋白水解物的結果接近(82.5 mg/g)[23]。

注:1為 Alcalase 2.4 L;2為Alcalase 2.4 L+ProteAXH;3為Alcalase 2.4 L+Corolase? LAP;4為Alcalase 2.4 L+Protamex;5為Alcalase 2.4 L+木瓜蛋白酶。圖2 Alcalase 2.4 L與其他蛋白酶復配對花生蛋白水解度、蛋白質回收率及水解物鈣結合能力的影響

2.2 脫酰胺對花生肽鈣結合能力的影響

脫酰胺可以將Asn和Gln轉化為Asp和Glu從而釋放出更多的羧基,進而增強多肽的鈣結合能力。Yuan等[9]和Bao等[10]采用酶法實現了花生蛋白鈣螯合肽的脫酰胺,本實驗則采用酸法進行處理。由圖3可知,用Alcalase 2.4 L單酶水解得到的花生肽脫酰胺后的鈣結合能力達到了95.57 mg/g,相比未處理之前提高了44.32%;而Alcalase 2.4 L和ProteAHX肽酶雙酶水解產物經脫酰胺后的鈣結合能力更是達到了132.04 mg/g,與對照相比提高了57.10%,表明脫酰胺是提高花生肽鈣結合能力的有效手段。這與袁興宇等[23]的結果一致,即用谷氨酰胺酶對花生蛋白的蛋白酶M水解物進行脫酰胺處理后,水解物的鈣結合能力由82.5 mg/g顯著提高至135.26 mg/g,同時在大豆蛋白肽中也觀察到了類似的效果[24,25]。這可能與花生蛋白中含酰胺的氨基酸含量較高有關,有研究表明,花生蛋白經硫酸脫酰胺化處理之后其在酸性條件下的溶解性提高了近5倍[26]。

注:1為Alcalase 2.4 L;2為Alcalase 2.4 L+脫酰胺;3為Alcalase 2.4 L+ProteAXH;4為Alcalase2.4 L+ProteAXH+脫酰胺。圖3 酸法脫酰胺處理對花生肽鈣結合能力的影響

2.3 脫酰胺花生肽鈣螯合工藝的優化

本研究采用單因素實驗對脫酰胺花生肽的鈣螯合工藝進行了優化。由圖4可知,在pH 3.0時多肽的鈣螯合能力最弱,為109.79 mg/g,在pH 4.0時顯著增至116.40 mg/g,但與pH 5.0～7.0時相比無顯著差異,在pH 8.0時則進一步顯著增加至131.43 mg/g。這可能是由于花生肽的pKa值在pH 3.0左右,在此pH值下,部分羧基處于未解離狀態,因此不能與鈣離子結合或只能以配位鍵的形式與鈣結合;當pH大于3.0時,多肽中的羧基處于解離狀態,因此能夠充分參與鈣離子的結合;當pH值進一步提高時,鈣離子的溶解性有所降低,化學反應平衡向著肽鈣螯合物的方向偏移,導致多肽的鈣結合能力進一步提升。這與豬骨膠原肽[16]和核桃肽[26]與鈣的結合行為類似,即堿性環境有利于螯合物的形成。

圖4 不同因素對脫酰胺花生肽鈣結合能力的影響

脫酰胺花生肽與鈣離子結合的最適溫度為50 ℃,隨著溫度的進一步升高或降低,多肽的鈣結合能力均有所降低,這一溫度與豬骨膠原蛋白肽與鈣的結合行為相同[17]。這是由于溫度升高加速了分子的遷移,從而使得多肽與鈣離子的結合速度加快;但是當溫度進一步升高時,多肽的結構發生了變化導致結合能力降低,同時溫度過高也會加速螯合物的解離,進而導致多肽的結合能力下降。

脫酰胺花生肽與鈣離子結合的最適時間為80 min,當反應時間進一步延長時結合能力略有下降,這與豬骨膠原肽與鈣的結合行為類似,但后者的最適結合時間為40 min[17],表明花生肽與鈣離子的結合過程是一個相對比較緩慢的過程。從圖4可知,隨著肽鈣質量比的增大,鈣結合能力呈先增大后減小的趨勢,在2∶1時達到最大值,表明在此比例下兩者達到了平衡。

脫酰胺花生肽與鈣離子結合的最適條件為在pH 8.0和50 ℃下按照2∶1的質量比反應80 min,此時脫酰胺花生肽的鈣結合能力達到了132.04 mg/g,與袁興宇等[23]用谷氨酰胺酶對花生蛋白的蛋白酶M水解物進行脫酰胺處理后的水解物的鈣結合能力接近(135.26 mg/g)。

2.4 脫酰胺花生肽的富集

Yuan等[9]通過超濾法對花生蛋白的蛋白酶M單酶水解物進行精制,得到了鈣結合能力為(124.70±0.80)mg/g的級分。為了進一步提高花生肽的鈣結合能力,本實驗采用大孔樹脂吸附的方式對其富集。在這種方法中,既可以通過吸附目標多肽然后再洗脫收集的方式得到高活性組分,也可以通過吸附除去低活性多肽的方式得到高活性組分,其中后者更加簡單可行,因此本實驗采用第2種策略對花生肽進行了富集,共選用了5種不同極性的大孔吸附樹脂,包括非極性的D101和XAD-2、弱極性的AB-8、中極性的DM301和強極性的ADS-7,以及2種離子交換樹脂,包括強堿性陰離子交換樹脂IRA900CI和弱酸性強離子交換樹脂IRC76RCF,進行了測試。

2.4.1 樹脂的篩選

從圖5中可以看出,大孔樹脂種類對吸附液中剩余多肽的鈣結合能力有重要影響,總體而言,經中等極性和強極性樹脂吸附后剩余多肽的鈣結合能力最強、多肽的損失率也最低,其中DM301吸附后剩余多肽的鈣結合能力最高,達到157.49 mg/g,多肽損失率20.00%;經弱極性樹脂AB-8吸附時多肽的損失率最大,剩余多肽的鈣結合能力最弱。離子交換樹脂類型對剩余多肽的鈣結合能力也有重要影響,其中經陰離子交換樹脂吸附后剩余多肽的鈣結合能力要顯著高于陽離子交換樹脂,但是仍略低于DM301的吸附液。結果表明,疏水性較強且攜帶正電荷的多肽似乎更加有利于其結合鈣離子,采用極性樹脂或陰離子交換樹脂是除去水解液中低鈣結合能力組分的有效手段。

注:1為對照組;2為D101;3為XAD-2;4為ADS-7;5為AB-8;6為DM301;7為IRA900C1;8為IRC76RCF。 圖5 樹脂種類對脫酰胺花生肽鈣結合能力及多肽損失率的影響

目前關于鈣螯合肽構效關系的研究較少,現有文獻表明多肽的分子質量及其攜帶基團如羧基、磷酸基等的數量對其鈣結合能力有一定的影響[28],但是關于多肽極性及荷電特性的影響鮮見報道。由于DM301對水解液中低鈣結合能力組分的吸附能力最強、造成的多肽損失率較小,因此對其吸附條件進行了進一步優化。

2.4.2 花生鈣螯合肽富集條件優化

圖6為pH值、溫度、時間及質量比對脫酰胺花生肽鈣結合能力的影響,當pH值為2.0時鈣結合能力最強;當吸附溫度為30 ℃時吸附液中多肽的鈣結合能力最強,這與極性樹脂的吸附特性較為一致;當吸附時間為12 h時樹脂的吸附達到完全,進一步延長吸附時間不能繼續提高多肽的鈣結合能力;當樹脂與多肽的質量比為10∶1時,水解液的鈣結合能力趨于穩定,為162.08 mg/g。

圖6 不同因素對DM301大孔吸附樹脂富集脫酰胺花生肽鈣結合能力的影響

因此,圖6表明,利用DM301富集脫酰胺花生肽的最佳條件為pH2.0、溫度30 ℃、吸附時間12 h、樹脂與多肽質量比10∶1,在此條件下,吸附液中多肽的鈣結合能力達到了164.34 mg/g,與未富集前的132.04 mg/g相比增加了24.46%。該結合能力顯著高于Yuan等[9]通過超濾富集得到的花生肽的(124.70 ± 0.80)mg/g,多肽的回收率也較高,表明本研究的雙酶水解結合酸法脫酰胺及DM301樹脂富集是從花生蛋白高效制備高活性鈣螯合肽的有效方法。同時,本研究所得的多肽的鈣結合能力也遠高于葵花籽蛋白肽的83.50 mg/g[15]、大豆蛋白肽的53.03 mg/g[29]以及乳清蛋白肽的67.81 mg/g[30],表明花生肽是一種活力非常強的鈣螯合劑。

2.5 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的表征

2.5.1 熒光光譜分析

圖7為不同濃度的CaCl2(5～25 μmol/L)分別與 0.2 mg/mL 的脫酰胺花生肽溶液混合后的熒光光譜圖。可以看出,隨著 CaCl2濃度的增加,355 nm處的發射峰強度減弱,這是因為鈣離子的引入使花生肽的內源熒光發生淬滅。熒光強度降低是多肽螯合鈣離子時結構發生變化的一個典型特征[31],在乳清蛋白[32]及鴨蛋白肽[33]與鈣離子結合時也觀察到了類似的現象,證實了花生肽與鈣離子與發生了螯合作用。

圖7 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的熒光光譜圖

2.5.2 圓二色譜分析

由圖8及表2可知,脫酰胺花生肽的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲結構質量分數分別為13.6%、15.4%、21.5%和49.5%;與Ca2+螯合后,其α-螺旋和β-轉角的含量無明顯變化,但是β-折疊的質量分數增加至32.3%,而無規則卷曲質量分數降至29.4%,表明花生肽由原先的無序結構向更加有序、致密的結構轉變。這一現象與Zhang等[34]的觀察一致,即鱈魚多肽與Ca2+螯合后其松散的二級結構變得規則、有序且緊密,進一步證實了花生肽與鈣離子形成了螯合物。

圖8 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的圓二色光譜圖

表2 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的二級結構質量分數/%

2.5.3 傅里葉紅外光譜分析

圖9 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的傅里葉紅外光譜圖

2.5.4 粒徑、電勢分析

如圖10所示,與鈣離子螯合后,花生肽的ζ電位從-38.1 mV 變為-10.5 mV,表明Ca2+與花生蛋白肽中帶負電荷的羧基發生了螯合,這與圖9的結果一致,這一現象和大豆蛋白肽與鈣離子結合后電勢的變化趨勢一致[29];另外,與鈣離子結合后,花生肽的粒徑由244 nm急劇增加至831 nm,這可能是由于鈣離子屏蔽了多肽鏈上的負電荷,降低了多肽鏈之間的靜電斥力,并通過形成鹽橋促進了多肽的聚集所致[36]。Fang等[27]研究核桃多肽與鈣離子的結合行為時,也發現了添加鈣離子會促進核桃多肽發生凝聚現象從而導致粒徑增大。

圖10 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的粒徑與ζ電位

3 結論

采用Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶和ProteAXH肽酶復合水解結合酸法脫酰胺和DM301大孔樹脂吸附得到了鈣結合能力達到164.34 mg/g的花生肽,該工藝的多肽總回收率達到72%。紅外光譜分析表明,花生蛋白肽主要通過其羧基與鈣離子發生結合作用。本實驗所得花生蛋白肽的鈣結合能力較高,同時制備工藝較為簡單、蛋白質回收率高,因此具有較好的工業化生產價值,這對于提升花生蛋白的綜合利用具有重要意義。在后續的產業化應用中,還需要對生產工藝進行進一步優化如適當提高酶解溫度或加酶量以縮短酶解反應時間,并對被吸附多肽的洗脫工藝和功能性質進行系統研究,有利于花生多肽綜合利用和降低生產成本。