辣木籽粕多肽亞鐵螯合物的制備及其結構分析

侯 健, 李美萍, 郭彩霞, 尉立剛

(山西大學生命科學學院,太原 030006)

生物活性肽是由2個及以上的氨基酸殘基組成的一類對生命有機體具有重要生理功能的功能分子,不同的來源、氨基酸組成和排列方式決定了不同的活性肽可能具有抗炎、抗菌、抗氧化、促進酒精代謝、降血壓、免疫調節等一種或多種生理功能[1,2],對于人體生理機能具有潛在的調節作用[3]。鐵是人體必須微量營養元素[4],是細胞色素、血紅蛋白、鐵蛋白、肌紅蛋白以及各種酶的重要組成部分,而且也參與體內的氧轉運和儲存、電子轉移反應、基因調節以及細胞生長和分化調節等重要過程[5]。人體內鐵的缺失會影響細胞代謝和機體生理生化等過程,從而導致機體的免疫功能受損[6]、腸道菌群紊亂[7]等一系列問題,對人體的營養與健康產生負面影響。

目前廣泛使用的鐵離子營養補充劑主要為無機鐵鹽類和小分子有機鐵鹽類[8],但各種金屬鹽類有可能會影響食品的物理和感官特性,同時還存在吸收率低,對腸道有刺激、穩定性差等缺點[9]。以蛋白多肽為載體,螯合亞鐵離子制得的生物性鐵補充劑,對比金屬鹽類補充劑不僅提高了亞鐵離子的穩定性、吸收率、安全性和生物利用度[10],同時金屬離子與多肽螯合之后也可能會增強多肽原本的生物活性,或者使多肽獲得一些本身不具備的生物活性[11],是一種潛在的金屬鹽類替代品。已有研究利用鴨蛋清[12]、魚鱗[13]、豌豆[14]、小米麩皮[15]等不同動物與植物性來源蛋白獲得亞鐵離子螯合肽。辣木籽是一種新興的藥食同源物,其提取油脂之后的加工副產物—辣木籽粕中蛋白質量分數占到50%以上,是良好的蛋白資源[16]。

目前對辣木籽粕多肽與亞鐵離子螯合的研究鮮有報道。本研究以辣木籽粕多肽為配體,以Fe2+為金屬螯合離子,制備辣木籽粕多肽-亞鐵螯合物,利用單因素和響應面實驗優化螯合物的制備工藝;通過光譜法分析螯合物的結構,并對其氨基酸組成進行分析,同時利用掃描電鏡觀察辣木籽粕多肽及其螯合物的微觀樣貌,以期開發辣木籽粕多肽-亞鐵營養補充劑,為提高辣木籽資源附加價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽粕酶解多肽液(實驗室自制)、氯化亞鐵、鄰菲羅啉、鹽酸羥胺、抗壞血酸、1-苯胺基-8-萘基磺酸鹽(ANS)、乙酸鈉、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

pH-220W型pH計,SC-3614低速離心機,UV-2550紫外-可見光譜儀,Nicolet380傅里葉變換紅外光譜儀,LS-55熒光分光光度計,Artemis6000C全自動氨基酸分析儀, JSM-IT500HR掃描電子顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 辣木籽粕多肽-亞鐵螯合物制備

參考文獻[17]并做一定修改。取一定濃度的辣木籽粕酶解多肽液,調節多肽液pH值,按照一定比例加入氯化亞鐵與抗壞血酸振蕩混勻,反應一定時間后離心(3 622 g×15 min)收集上清液,加入5倍體積的乙醇靜置沉淀3 h,離心(3 622 g×15 min)收集沉淀,凍干得到辣木籽粕多肽-亞鐵螯合物。

1.3.2 單因素實驗

辣木籽粕多肽與亞鐵離子進行螯合,以pH=5、多肽質量濃度8.8 mg/mL、肽鐵質量比為4∶1、螯合溫度40 ℃、螯合時間20 min為基礎條件,亞鐵螯合率為考察指標,探究螯合pH值(3、4、5、6、7)、肽鐵質量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)、多肽濃度(1.1、2.2、4.4、6.6、8.8、10.0 mg/mL)、螯合溫度(25、40、50、60、70 ℃)、螯合時間(5、10、20、30、40、50、60 min)各因素對螯合率的影響。

1.3.3 響應面優化實驗

在單因素實驗基礎上,固定螯合時間20 min、螯合溫度40 ℃,選取肽鐵質量比、多肽濃度、pH值為考察因素(分別以A、B、C 表示),以亞鐵螯合率為響應值設計3因素3水平響應面分析實驗,其因素水平見表1。

表1 響應面因素和水平

1.3.4 亞鐵離子螯合率的測定

鐵含量測定采用鄰菲羅啉[18]比色法:以氯化亞鐵質量濃度x(mg/mL)為橫坐標,以吸光度y為縱坐標繪制標準曲線,得到標準曲線方程為y=8.080 5x+0.013 7,R2=0.999。

然后對樣品進行測定,帶入標曲計算樣品中氯化亞鐵的量。

式中:c為稀釋樣品中氯化亞鐵的質量/mg;n為樣品測定時的稀釋倍數;m為添加的氯化亞鐵的總質量/mg。

1.3.5 紫外光譜分析

分別取一定量的辣木籽粕多肽、多肽-亞鐵螯合物、氯化亞鐵和抗壞血酸用水溶解,在紫外-可見光譜儀200～450 nm全波段掃描。

1.3.6 紅外光譜分析

稱取適量樣品和溴化鉀于瑪瑙研缽中研磨混勻[樣品和溴化鉀質量比在1∶(100～150)],之后置于壓片機內50 MPa保持1 min壓制成片,在4 000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1條件下,掃描32次,獲得紅外光譜圖。

1.3.7 表面疏水性指數S的測定

依據Liu等[19]的方法略作修改。用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.0)將辣木籽粕多肽液進行稀釋,使其梯度質量濃度為 0.022、0.055、0.110、0.220、0.330、0.440 mg/mL;同時用磷酸鹽緩沖液配制不同質量濃度的多肽-亞鐵螯合物溶液(0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL)。將不同濃度的樣品(4 mL)與20 μL的ANS熒光探針(8 mmol/L,用pH=7.0,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液配制)渦旋混勻,避光靜置15 min。在激發波長、發射波長分別為390 nm和500 nm,狹縫寬度為5 nm條件下測定樣品的熒光強度。以樣品濃度為橫坐標,熒光強度為縱坐標擬合曲線,直線斜率即為樣品的表面疏水性指數S。

1.3.8 熒光光譜分析

根據Xi等[20]研究方法測定樣品熒光光譜。將辣木籽粕多肽液、多肽-亞鐵螯合物等樣品用水溶解稀釋,獲得不同濃度的樣品溶液。固定激發波長為285 nm,狹縫寬度為5 nm,掃描樣品在300～550 nm 范圍內的熒光發射光譜。

1.3.9 多肽-亞鐵螯合物的氨基酸組成分析

參照國標GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》的方法進行測定。

1.3.10 掃描電鏡及能譜分析

采用掃描電子顯微鏡(SEM)聯用X射線能譜儀(EDS)觀察辣木籽粕多肽與多肽-亞鐵螯合物的表面微觀形貌,分析螯合前后樣品表面的元素組成。

1.3.11 數據處理

使用Design-Expert V8.0.6和Origin 2019b對數據進行處理分析與作圖。

2 結果與討論

2.1 辣木籽粕多肽-亞鐵螯合物制備單因素實驗

由圖1可知,辣木籽粕酶解多肽與亞鐵離子的螯合率隨pH的增加先上升后下降。在pH值較低時反應體系中含有大量的H+,而H+會與供電子基團反應形成氧化物沉淀,與亞鐵離子之間產生競爭關系,導致螯合率較低;隨著pH值的上升,反應體系中H+濃度逐漸減小、OH-濃度逐漸增大,OH-也會與供電子基團產生競爭關系,爭搶亞鐵離子反應生成氫氧化物沉淀,從而使螯合率降低[21],故選擇最適pH=5。在肽鐵質量比從1∶1～4∶1逐漸增加時,辣木籽粕酶解多肽與亞鐵離子螯合率也逐漸上升,而當肽鐵質量比大于4∶1時,亞鐵螯合率又開始緩慢下降。辣木籽粕多肽結合亞鐵離子的量是一定的,在質量比較小時亞鐵離子較多,多肽沒有足夠的活性位點與之結合,造成亞鐵離子的浪費;而在質量比較大時,亞鐵離子的含量較低,螯合物的結構不穩定,對螯合率也有一定的影響[22],所以選擇最適肽鐵質量比為4∶1。

圖1 各因素對辣木籽粕多肽-亞鐵物螯合率的影響

在多肽質量濃度從2.2～8.8 mg/mL逐漸增加時,辣木籽粕酶解多肽與亞鐵離子螯合率也逐漸上升,而當多肽質量濃度大于8.8 mg/mL后,亞鐵螯合率又開始緩慢下降。這可能是由于多肽在低濃度條件下體系的流動性比較好,多肽與亞鐵離子不易形成穩定的絡合物,而高濃度多肽液體系流動性又會減弱,使多肽與亞鐵離子不能夠充分接觸,從而導致螯合能力下降[23],故選擇最適多肽濃度為8.8 mg/mL。隨著溫度和時間的變化,螯合率雖然也呈現先上升后下降的變化,但是變化趨勢平緩,對于螯合率的影響較小,故確定螯合溫度為40 ℃,螯合時間為20 min。

2.2 響應面實驗優化多肽-亞鐵螯合物制備工藝

2.2.1 響應面實驗設計及結果

在單因素實驗基礎上,固定螯合溫度為40 ℃,螯合時間為20 min,選取肽鐵質量比、多肽濃度、pH值為考察因素(分別以A、B、C 表示),以螯合率為響應值設計三因素三水平響應面分析實驗。響應面實驗設計及結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果

利用Design-Expert對表2中的實驗數據進行回歸擬合,得到各因素與螯合率的二次多項回歸模型方程:Y=88.21+3.19A-1.94B-3.25C+2.82AB+1.16AC+0.93BC-8.9A2-4.640B2-5.55C2。

2.2.2 響應面模型建立與顯著性分析

對亞鐵螯合率的二次多項回歸模型進行方差分析和顯著性檢驗,結果如表3所示。

表3 回歸方程方差分析

對亞鐵離子螯合率的回歸模型系數進行顯著性檢驗,可知模型的一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2以及AB影響極顯著;通過對回歸系數的比較可知,各因素對辣木籽粕多肽與亞鐵離子螯合率的影響次序為:C(pH)>A(肽鐵質量比)>B(多肽質量濃度)。

2.2.3 最佳參數的確定及模型驗證

通過Design-Expert軟件的預測分析功能,優化得到辣木籽粕多肽與亞鐵離子螯合的最佳條件為:肽鐵質量比4.13∶1,多肽質量濃度7.92 mg/mL,pH=4.70,在此條件下多肽提取率預測值為89.09%。結合實際操作情況,調整螯合工藝為:肽鐵質量比4.1∶1,多肽質量濃度7.90 mg/mL,pH=4.70。在調整后的條件下進行3次平行實驗,辣木籽粕多肽與亞鐵離子的螯合率為(88.27±1.49)%,這與模型的預測值很接近,證明了二次多項回歸模型方程的可靠性。

2.3 多肽-亞鐵螯合物的紫外光譜分析

如圖2所示,氯化亞鐵在200～450 nm區間內沒有明顯的吸收峰;辣木籽粕多肽在267 nm附近有1個特征吸收峰,VC的特征吸收峰最大吸收波長在264 nm處;辣木籽粕多肽與VC混合之后在267 nm處與辣木籽粕多肽相同的吸收峰,且其吸光度值與辣木籽粕多肽+VC的吸光度值接近,表明在反應體系中加入VC對于辣木籽粕多肽的結構沒有太大的影響;而辣木籽粕多肽-亞鐵螯合物在267 nm附近的吸收峰消失,且相對于辣木籽粕多肽吸收峰值有所增強,由此可以推斷有新的物質生成[24]。Athira等[25]將乳清蛋白衍生肽與亞鐵離子螯合之后的紫外光譜圖也表現出類似的變化。

圖2 酶解多肽與螯合物紫外吸收光譜

2.4 多肽-亞鐵螯合物的熒光光譜分析

2.4.1 表面疏水性

圖3通過對熒光強度和樣品濃度做曲線得出:多肽的表面疏水指數S0=1 445,螯合物的表面疏水指數S1=708,螯合物相對于多肽的表面疏水性顯著下降。可能是與非極性氨基酸相比,極性氨基酸更易于與亞鐵離子結合[26],從而螯合物中極性氨基酸可能較多,非極性氨基酸較少;而非極性氨基酸所占比例越低,樣品表現出來的表面疏水性越低[27],從而螯合物的表面疏水性相對于多肽會顯著下降。

圖3 酶解多肽與螯合物的表面疏水性

2.4.2 熒光光譜圖

如圖4所示,酶解多肽在367 nm附近出現最大發射峰;FeCl2和VC在367 nm處沒有顯示熒光強度,不會對螯合物的熒光強度產生影響。與酶解多肽相比,螯合物的最大發射波長產生輕微的紅移(從367 nm移動到371 nm),且熒光強度明顯減弱。最大發射波長移動與熒光強度降低是多肽結構發生折疊變化的典型標志[28],可能是多肽與亞鐵離子螯合, 導致多肽中色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸的構象發生了變化,使其固有熒光發生猝滅作用,熒光強度下降[29]。結果表明多肽與亞鐵離子螯合之后產生了一種新的物質。

圖4 酶解多肽與螯合物熒光光譜

2.5 多肽-亞鐵螯合物的紅外光譜分析

圖5 酶解多肽及其螯合物的紅外光譜

2.6 多肽-亞鐵螯合物掃描電鏡及能譜分析

辣木籽粕酶解多肽與螯合物的電子掃描顯微鏡圖如圖6所示,多肽的微觀結構相對松散,表面光滑且呈不規則片狀;而螯合物微觀結構更加緊密,表面主體顆粒狀呈交織結構;Wang等[32]制備的南極磷蝦肽-鐵復合物也有類似的形態。多肽與螯合物在表觀形態發生了明顯變化,說明亞鐵離子與辣木籽粕多肽中的基團結合產生了新物質。同時對多肽和螯合物進行能譜分析(EDS),結果如表4所示。

圖6 多肽及螯合物的掃描電鏡圖

表4 多肽與螯合物中各元素質量分數/%

由表4可知,多肽中的主要元素為C、O、S等,這些元素質量分數占到了90%以上;而螯合物中主要元素除了C、O、S外,還含有質量分數11.15%左右的鐵元素,表明亞鐵離子與多肽之間的確通過螯合作用成功結合在一起。

2.7 多肽-亞鐵螯合物的氨基酸組成分析

辣木籽粕多肽在螯合前后的氨基酸組成及含量如表5所示。辣木籽粕多肽及其螯合物的氨基酸有16種,辣木籽粕多肽中Glu、Arg、Leu、Gly含量相對較高,此外還有Asp、His、Lys、Ala、Val、等氨基酸,Cys質量分數最低(<0.01%);已有研究證實His、Glu、Asp、Lys、Cys等氨基酸的殘基側鏈均可提供與亞鐵離子結合的配體,會在與金屬螯合反應中起到關鍵作用[33,34]。與辣木籽粕多肽相比,螯合物中氨基酸組成有所改變,其中Cys與Arg的質量分數分別增加了2.66%與4.17%,His、Lys、Glu等極性氨基酸也有不同程度的增加,表明這幾種氨基酸都參與了亞鐵的螯合。而螯合物中Ala、Val、Leu、Phe等疏水性氨基酸總質量分數從29.09%下降至20.38%,可能相比于疏水性氨基酸,親水性氨基酸的存在更有助于多肽與亞鐵的螯合[35],這與表面疏水性分析結果相吻合。

表5 辣木籽粕多肽螯合前后氨基酸含量變化與分析

3 結論

研究以辣木籽粕多肽和氯化亞鐵為原料,以螯合率為指標,采用單因素實驗及響應面法優化得出了多肽亞鐵螯合物的最佳制備工藝為:肽鐵質量比為4.1∶1,多肽質量濃度為7.9 mg/mL,pH=4.70,反應溫度為40 ℃,反應時間為20 min,在此條件下亞鐵的螯合率為(88.27±1.49)%。