米糠蛋白復合戊聚糖糖基化反應條件的優化及性質研究

冷雪冬, 孫華軍, 朱 磊, 陳明明, 宋 妍, 楊斯琪, 錢麗麗,2,3

(黑龍江八一農墾大學食品學院1,大慶 163319)

(國家雜糧工程技術研究中心2,大慶 163319)

(黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室3,大慶 163319)

米糠是稻米加工的副產物,其中的營養成分占稻谷中總營養成分的64%[1],是一種廉價的蛋白質來源,其質量分數為10%～16%。米糠蛋白是一種優質的植物蛋白[2],主要是由清蛋白(37%)、球蛋白(36%)、醇溶蛋白(5%)、谷蛋白(22%)組成。米糠蛋白具有生物效價高等特點,在營養方面具有優越性,氨基酸組成合理平衡,相比而言賴氨酸和蘇氨酸含量更高,是嬰兒和特殊人群營養食品的合適成分[3-7]。由于米糠蛋白的一些功能特性較差,因此采用糖基化方法改善米糠蛋白的功能特性(例如溶解性、乳化性、起泡性等),眾多研究表明糖基化改性能對蛋白質的功能性質進行改善[8,9],并且反應條件簡單、迅速。

蛋白質改性方法主要有物理方法、化學方法和生物酶法[10]。物理方法是通過適度的熱變性、擠壓膨化和超高壓等方法改變蛋白質的高級結構和分子間的聚集方式,從而改善蛋白的功能性質[11];化學方法包磷酸化、糖基化、脫酰胺化和共價交聯作用等方法改變蛋白質的結構來改善其功能特性[12];生物酶法主要有蛋白酶、過氧化物酶等,通過對蛋白質分子中多肽鏈的斷裂、分子交聯或對側鏈基團進行修飾,從而改變蛋白質分子的組成及理化性質影響其功能特性[13]。糖基化是將糖鏈以共價鍵的形式與蛋白質分子上的氨基相連接而形成糖蛋白,此反應僅在加熱條件下自發進行不需添加催化劑[14]。戊聚糖具有多種生理活性,有益于促進腸道內雙歧桿菌及乳桿菌的繁殖[15-17]、降血糖[18-20]等。糖基化反應使其米糠蛋白分子中插入羥基從而改善蛋白質的溶解度、起泡性和乳化性能等。

本實驗選用米糠蛋白和戊聚糖進行糖基化反應,制備米糠蛋白戊聚糖復合物,通過在不同的反應條件(pH、溫度、時間、米糠蛋白-戊聚糖比例)對該接枝反應進行分析,在單因素的基礎上進行響應面分析,得出最優的米糠蛋白戊聚糖復合物制備工藝參數。并對米糠蛋白戊聚糖復合物和米糠蛋白的褐變程度、溶解性進行比較,以期為米糠蛋白戊聚糖復合物的制備及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠蛋白(純度90%)、戊聚糖(純度98%)。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、四硼酸鈉,均為分析純;鄰苯二甲醛(o-Phthalic Aldehyde,OPA)、十二烷基硫酸鈉(SDS),分析純,β-巰基乙醇,生化試劑。

1.2 儀器與設備

BSA-120.4電子天平,SYG-1210恒溫水浴鍋,UV-2008紫外分光光度計,HJ-3恒溫磁力攪拌器,ALPHA1-2真空冷凍干燥機。

1.3 實驗方法

1.3.1 米糠蛋白戊聚糖復合物的制備

稱取一定量的米糠蛋白,溶于pH=10的磷酸緩沖溶液中,使其體積分數為1%,磁力攪拌30 min以充分溶解。將不同比例米糠蛋白(1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)與戊聚糖充分混合,進行磁力攪拌,反應的時間和溫度不同。將樣品錐形瓶放置在60 ℃的水浴鍋中保溫反應90 min,反應過程中每隔15 min取樣測定褐變值。樣品置于3 500 r/min離心20 min除去不溶性物質,進行冷凍干燥。

1.3.2 米糠蛋白戊聚糖復合物接枝度的測定

接枝度(DG)采用鄰苯二醛(OPA)法[21]測定:稱取80 mg OPA,在2 mL甲醇溶液中攪拌;將50 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液、5 mL 200 mg/mL SDS溶液、200 μLβ-巰基乙醇充分混勻,加入OPA甲醇溶液攪拌,定容至100 mL于棕色瓶中。樣品測定時,稱取4.00 mL OPA溶液,加入200 μL樣品溶液,置于35 ℃水浴中2 min后測定340 nm處吸光值。用去離子水做為空白對照組。接枝度(DG)按公式進行計算:

式中:A0為反應前溶液吸光度值;A1為取樣樣品溶液吸光度值。

1.3.3 米糠蛋白戊聚糖復合物單因素實驗

1.3.3.1 溶液pH對接枝反應的影響

固定蛋白的質量分數為1%,設置pH分別為7、8、9、10、11作為實驗條件,其他條件為反應時間60 min、反應溫度40 ℃及米糠蛋白復合戊聚糖比例為1∶2,進行單因素實驗,考察不同pH對接枝度的影響。

1.3.3.2 反應時間對接枝反應的影響

固定蛋白的質量分數為1%,設置反應時間分別為30、40、50、60、70、80 min作為實驗條件,其他條件為pH=10、反應溫度40 ℃及米糠蛋白復合戊聚糖比例為1∶2,進行單因素實驗,考察不同反應時間對接枝度的影響。

1.3.3.3 反應溫度對接枝反應的影響

固定蛋白的質量分數為1%,設置反應溫度分別為20、30、40、50、60、70、80 ℃作為實驗條件,其他條件為pH=10、反應時間60 min及米糠蛋白復合戊聚糖比例為1∶2,進行單因素實驗,考察不同反應溫度對接枝度的影響。

1.3.3.4 米糠蛋白復合戊聚糖比例對接枝反應的影響

固定蛋白的質量分數為1%,設置米糠蛋白復合戊聚糖分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4作為實驗條件,其他條件為pH=10、反應時間60 min及反應溫度40 ℃,進行單因素實驗,考察不同米糠蛋白復合戊聚糖比例對接枝度的影響。

1.3.4 米糠蛋白戊聚糖復合物響應面優化實驗

在單因素實驗基礎上,采用響應面分析法考察溶液pH(A)、反應時間(B)、反應溫度(C)和米糠蛋白復合戊聚糖比例(D)4個因素與接枝度(Y)進行響應面實驗設計,響應面實驗因素與水平表如表1所示。

表1 因素與水平

1.3.5 米糠蛋白戊聚糖復合物褐變度的測定

測定不同比例樣品溶液,在不同反應時間段褐變度的變化。取樣品溶液于離心管中,在3 500r/min條件下離心15 min,取上清液,用蒸餾水做空白,用0.1 mg/100 mL的SDS溶液稀釋,在420 nm處測定吸光度[22],以此表示體系的褐變程度。

1.3.6 米糠蛋白戊聚糖復合物溶解度的測定

分別配置pH值分別為 3、4、5、6、7、8、9的磷酸鹽緩沖液,溶解米糠蛋白及其復合物制成1 mg/mL的溶液,混合均勻。在室溫下放入離心機,3 500r/min離心力下離心20 min。取上清液在280 nm 處測量吸光度,每個樣品重復3次。

1.4 數據處理

數據分析和響應模型的建立由Origin 2019和Design Expert 8.6.0軟件處理,采用SPSS26.0軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 米糠蛋白戊聚糖復合物單因素實驗

由圖1可知,隨著溶液pH值的逐漸增大,米糠蛋白戊聚糖復合物的接枝度呈現上升趨勢,當pH值為7～10時,接枝度顯著上升,當pH等于10時接枝度最大為28.38%,pH值在10～12呈下降趨勢,差異不顯著。隨著pH值增大使得溶液的堿性越大,濃度過高會使米糠蛋白發生變性和蛋白交聯,導致蛋白質結構發生改變,從而降低樣品的接枝度。接枝度在反應時間為60 min時有最高值為28.58%。此后接枝度隨著反應時間的增長呈現下降趨勢,最后趨于平緩。隨著反應時間的增加,米糠蛋白分子結構開始發生變化,米糠蛋白中的氨基與戊聚糖中的羥基進行接枝反應;隨著反應持續進行,接枝度在70 min后趨于平緩。隨著反應溫度的升高,接枝度呈現先升高后下降的趨勢,在40 ℃取得最高值為28.49%。隨著反應溫度的升高,米糠蛋白結構發生輕微改變,分子中的游離氨基含量升高,濃度增加從而提高接枝反應速率,接枝度顯著升高。但溫度過高會引發蛋白的熱變性和粒子重新聚集,游離氨基酸含量降低,從而導致接枝度下降。當米糠蛋白與戊聚糖質量比為1∶2時,其接枝度最高為28.96%,此后接枝度隨著戊聚糖添加比例的改變呈現下降趨勢,由于蛋白添加比例變小,戊聚添加比例增大,溶液黏稠度增加從而不利反應的發生,導致接枝度的下降。在一定的添加范圍內,增加戊聚糖濃度,可提高米糠蛋白的游離氨基與戊聚糖中的羥基反應,使接枝反應向正反應方向進行。根據單因素實驗可知,選取pH 10、反應時間60 min、反應溫度40 ℃和米糠蛋白-戊聚糖比例1∶2作為最佳的單因素制備工藝條件。

圖1 米糠蛋白戊聚糖復合物單因素影響

2.2 米糠蛋白戊聚糖復合物響應面實驗

2.2.1 方差分析及回歸方程

以單因素實驗作為依據得出結論,響應面實驗方案及結果如表2所示。

表2 響應面實驗方案及結果

以pH(A)、反應時間(B)、反應溫度(C)、米糠蛋白-殼聚糖質量比(D)為自變量,可得出接枝度的回歸方程為:Y=28.81-0.44A-0.57B+0.13C+1.05D-2.06AB-0.72AC+1.75AD-0.69BC+0.48BD+0.26CD-2.09A2-2.67B2-0.58C2-1.39D2。

表3 響應面回歸方程方差分析

2.2.2 響應面分析與優化

影響米糠蛋白戊聚糖復合物的接枝度的各個因素之間的交互作用。由各因素交互作用的響應面圖,根據響應面陡峭程度和F值可以得出4個因素對米糠蛋白戊聚糖復合物接枝度的影響程度為:接枝反應溫度(℃)>接枝反應時間(min)>pH>米糠蛋白復合戊聚糖質量比(g/g)。通過響應面優化可知最佳工藝參數為pH=10.11、反應時間58.71 min、反應溫度44.15 ℃及米糠蛋白復合戊聚糖質量比1.00∶2.21時,在此條件下接枝度為29.07%。考慮到實際操作,將實際實驗條件調整為反應溫度44 ℃、反應時間60 min、pH=10米糠蛋白復合戊聚糖質量比1∶2,進行3次重復實驗,取平均值得到接枝度度為29.01%,與實際相符,則模型可以較好地預測米糠蛋白戊聚糖復合物的制備。

2.3 米糠蛋白戊聚糖復合物褐變度的測定

美拉德反應會有褐色產物產生,褐變度是通過呈色物質吸光度的變化來表現美拉德反應的高級產物的形成[23],褐變程度的增加也表明反應進行程度。由圖2可知,反應時間的逐漸延長,吸光度在前45 min逐漸增大,之后趨于平緩,當反應時間到70 min以后美拉德反應呈現結束或逆轉。隨著戊聚糖添加量增加,同一時刻不同比例樣品的美拉德反應的呈現先增加后減小趨勢,當添加比例為1∶2時吸光度值最高,而當比例為4∶1、3∶1或1∶4、1∶3時吸光度值有所下降,表明戊聚糖或米糠蛋白濃度提高對于美拉德高階反應有抑制作用。

圖2 米糠蛋白戊聚糖復合物褐變度的測定

2.4 米糠蛋白戊聚糖復合物溶解度的測定

由圖3可知,上清液的吸光度值越高,其溶解度越高。在pH為3～9之間,溶解度先減少后增加,在pH=4附近最低,通過前后對比分析可知,米糠蛋白戊聚糖復合物的溶解度高于米糠蛋白的溶解度。溶解度與蛋白質的性質有關[24],蛋白質在酸性或堿性條件下,體系中電荷的增加,有利于蛋白分子與水分子間作用,溶解性呈現逐漸增大趨勢[25]。可知糖基化改性能提高米糠蛋白溶解度對于pH變化環境下的敏感性,使得糖基化后的米糠蛋白與水的親和力進一步提高。

圖3 糖基化反應對米糠蛋白溶解度的影響

3 結論

實驗以米糠蛋白和戊聚糖為原料,采用糖基化方法進行復合,探究不同反應條件對接枝度的影響。通過響應面試驗建立其模型并進行工藝優化,得到米糠蛋白戊聚糖復合物優化后的最佳工藝條件為pH=10.11、反應時間58.71 min、反應溫度44.15 ℃及米糠蛋白復合戊聚糖質量比1.00∶2.21時,在此條件下接枝度為29.07%。獲得最優的制備條件,為后續米糠蛋白特性的研究提供了基礎。