基于孟德爾隨機化分析腸道菌群與骨密度的因果關系

馬瑋瑋 陳虹谷 李彤彤 熊勇 李瑛*

1.湖北中醫藥大學,湖北 武漢 430061 2.江蘇大學附屬醫院,江蘇 鎮江 212000

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨量減少、骨小梁緩慢流失和骨密度損失為特征的全身性代謝骨疾病[1]。流行病學調查研究顯示,目前全球有超過2億人受到OP的困擾,中國50歲以上人群中OP患病率高達19.20%[2],預計隨著全球人口老齡化的加重,未來這一數字將繼續擴大[3]。腸道菌群(gut microbiota,GM)作為人體內重要的微生態系統,與人體健康息息相關。隨著腸道菌群在骨代謝領域研究的深入,有學者提出“腸-骨”軸理論[4-5],指出腸道菌群在人體骨代謝過程中發揮重要作用。近年來的研究表明腸道菌群通過調節激素和免疫功能影響人體營養物質的吸收與代謝,從而對人體骨代謝進行調節[6-7]。基于腸道菌群相關研究,飲食干預、益生菌補充和微生物群移植被用于OP的治療[8-9]。但上述研究多是臨床觀察性研究的結果,可能受到各種偏倚和混雜因素的影響以及反向因果的干擾。

孟德爾隨機化(mendelian randomization analysis,MR)是利用遺傳變異作為工具變量來識別危險因素與疾病之間因果關系的有效方法[10-11]。孟德爾的獨立分配法則表明遺傳變異是彼此獨立的,它們通常不受其他因素或混雜變量的影響。因此,MR研究中的關聯性比隨機化臨床試驗(randomized clinical trial,RCT)結果更可靠[12]。本研究利用來自全基因組關聯研究數據(genome-wide association studies,GWAS)的公共數據進行雙樣本MR分析以探討GM與骨密度(bone mineral density,BMD)之間的關系。

1 資料與方法

1.1 研究設計

本研究選擇GM作為暴露因素,選擇與GM相關的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNPs)作為工具變量(instrumental variables,IVs)。骨密度在臨床實踐中被廣泛用作骨質流失的可測量和強預測指標,被用作結果變量。使用雙樣本MR分析的方法對GM與BMD進行孟德爾隨機化分析,并利用Cochran’s Q與MR Egger法檢驗評估異質性與水平多效性,最后進行敏感度分析來驗證結果的穩定性。

MR分析需要滿足3個條件假設[13]:①IVs與暴露因素之間存在很強的關聯性;②IVs在暴露和結果的關聯性上不存在混合因素,即不存在遺傳多態性;③IVs對結果沒有直接影響,只能通過暴露因素影響結果。見圖1。

圖1 兩樣本孟德爾隨機化模型示意圖Fig.1 Schematic diagram of two sample Mendelian randomization models

1.2 數據來源

本研究通過英國布里斯托爾大學(University of Bristol) 的IEU GWAS數據庫 (https://gwas.mrcieu.ac.uk/terms/)分別獲取GM和BMD的GWAS。其中GM數據來自于MiBioGen聯合會的一項研究,分析了18 340名參與者的宿主基因型和16S糞便菌群rRNA基因測序剖面[14]。在這項GWAS研究中檢查了211個GM分類群(從屬到門級別),最終確定了與9個門、16個綱、20個目、35個科和131個屬相關聯的腸道菌群遺傳變異[14]。本研究使用的BMD數據來自于一項大規模GWAS薈萃分析的總體水平數據,該分析中包括30個項目研究和66 628名參與者(其中56 284名參與者為歐洲血統),其中全身骨密度(total body BMD,TB-BMD)通過DXA進行測量(以g/cm2為單位)[15]。TB-BMD的SNPs已經通過線性回歸模型進行協變量校正(年齡、體重、身高等)[15]。

1.3 工具變量選擇

為了滿足第一個關鍵假設,即相關性假設,IVs應該與暴露因素具有顯著相關[16]。本研究通過GWAS數據集在全基因組水平(P<1×10-8)上確定與GM相關的SNPs[17]。隨后,通過連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)聚類獲得暴露的獨立SNPs,聚類閾值為R2<0.1,等位基因距離大于500 kb[18]。然后從GWAS數據集中提取與BMD相關的SNPs及其相應的統計數據,同時排除MAF低于0.01的SNPs[19]。僅考慮分析中具有關聯估計的遺傳變體,未使用代理變量。此外,通過刪除所有回文SNP,數據得到協調[20]。為了滿足第二個MR假設,即獨立性假設,筆者使用PhenoScannerV2數據庫(http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/)研究每個IV及其代理特征,并在R2>0.80的閾值上去除和混雜因素相關的SNPs[21]。

1.4 孟德爾隨機化分析

本研究中主要采用逆方差加權法(inverse variance weighted,IVW)、MR-Egger回歸和加權中位數法(weighted median estimator,WME)進行MR分析。在滿足所有SNP都是有效的工具變量的假設下,IVW方法能提供最為準確的效應估計值[22]。MR-Egger回歸可以檢測和調整多效性,但這種方法產生的估計精度非常低[23]。加權中位數基于至少50%的IVs是有效的假設,給出準確的估計結果[24]。由于IVW法比其他兩種方法檢驗效能更高,因此本研究采取IVW法作為主效分析[24]。

1.5 敏感性分析

留一法通過逐個剔除某個工具變量來探討是否存在單個SNPs驅動因果關聯,如果剔除單個SNPs后對MR分析影響較大,則表明MR分析受單個工具變量的干擾。其次,MR-Egger截距用于評估IVs與其他潛在混雜因素間的多效性關系,確保選擇的IVs不會通過除暴露因素以外的途徑影響結局變量。若MR-Egger截距分析表明存在明顯的統計學意義(P<0.05),則表明存在水平多效性[25]。最后,本研究還使用Cochran’s Q 統計量來進行異質性檢驗。若Cochran’s Q 統計量檢驗具有統計學意義(P<0.05),則證明分析結果具有顯著的異質性[26]。

1.6 統計學分析

本研究使用RStudio軟件中的TwoSampleMR包進行數據分析,結果用β值以及相應的95%置信區間(confidence interval,CI)來解釋GM對BMD的影響,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 孟德爾隨機化結果

首先,確定與腸道菌群在門、綱、目、科和屬水平上相關的SNPs,經過一系列的質控步驟,選出的IVs進行孟德爾隨機化研究,IVW結果表明巴氏桿菌屬(OR=1.07,95%CI:1.02～1.13,P=0.01)、乳鏈球菌屬(OR=1.04,95%CI:1～1.08,P=0.01)、瘤胃球菌科UCG002(OR=1.06,95%CI:1～1.13,P=0.03)和瘤胃球菌科UCG005(OR=1.06,95%CI:1～1.12,P=0.03)可能是骨密度的保護性因素。但戈登氏桿菌屬(OR=0.96,95%CI:0.93～0.99,P=0.01)、草酸梭菌屬(OR=0.96,95%CI:0.92～0.99,P=0.01)和泰瑟氏菌屬(OR=0.95,95%CI:0.92～0.99,P=0.02)可能為骨密度潛在危險性因素,同時可能存在未知腸道菌群對骨密度造成潛在威脅(OR=0.94,95%CI:0.92～1.00,P=0.002),見圖2。同時也運用MR-Egger回歸和加權中位數法對腸道菌群與骨密度之間的關系進行分析,見表1。

表1 與BMD具有顯著相關性的腸道菌群MR效應值Table 1 MR effect values of gut microbiota with significant correlation with BMD

圖2 與BMD具有因果聯系的腸道菌群效應值森林圖Fig.2 Forest map of gut microbiota effect values with causal relationship with BMD

2.2 敏感性分析

Cochran’s Q和MR-Egger回歸法結果表明本研究不存在顯著的異質性和多效性(表2)。留一法結果顯示在逐一剔除SNP后,結果并沒有發生改變。這些分析在一定程度上證明了本研究結果的穩健性。

表2 敏感性分析結果Table 2 Sensitivity analysis results

3 討論

本研究旨在探討腸道菌群是否與骨密度之間存在因果聯系,通過孟德爾隨機化全面評估了211種腸道菌群(從門到屬的級別)對骨密度的因果效應,結果顯示某些腸道菌群與骨密度之間存在因果聯系,這些結果表明腸道菌群可能是骨密度的重要影響因素,同時也意味著腸道菌群在骨質疏松癥發病過程中發揮了重要作用。

大量的臨床觀察性研究表明GM同BMD之間存在聯系,這與本研究結果是一致的[27-31]。在人體中腸道菌群主要為厚壁菌門和擬桿菌門,占腸道菌群相對豐度的90%以上,其次是放線菌門、變形菌門、聯合菌門、梭菌門等[32]。骨骼是一個不斷進行骨形成和骨吸收的動態器官,這兩個過程是骨代謝的主要活動。骨細胞在體內進行新陳代謝,參與各種骨骼組織的生理和病理過程。在細胞層面,骨細胞之間的相互作用對于骨骼的形態起著關鍵作用。破骨細胞和成骨細胞是骨代謝的關鍵組成部分,而骨代謝失衡可引發骨質疏松癥。因此,骨穩態需要保持骨代謝的平衡。平衡的骨代謝對于維持鈣、磷等礦物質的代謝平衡以及骨密度和骨強度具有重要的積極作用。隨著對腸道菌群研究的不斷深入,其與骨代謝的關系也得到了更多關注。

目前研究還沒有完全確定GM與BMD之間的作用機制,但以往的一些研究探討了GM和BMD之間可能存在的幾種機制:①腸道菌群可以影響雌激素代謝調控骨代謝。正常情況下,雌激素作為腸肝循環產物需要經腸道菌群作用后才能重新進入內循環。當腸道菌群失衡時,腸肝循環減弱,機體內雌激素重吸收能力下降,加速體內骨質的流失與骨質疏松癥的病程[33-34]。②腸道菌群通過炎癥因子影響骨代謝。炎癥反應引起局部的免疫細胞浸潤,釋放多種炎癥因子,包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)等,這些炎癥因子可通過多種機制影響骨細胞的代謝和功能[35-36]。當人體內腸道菌群失衡后可刺激腸道內的炎癥反應,導致IL-6和TNF-α等炎性因子大量釋放,在促進破骨細胞活性的同時也抑制成骨細胞的形成和功能,最終加劇骨代謝的失衡。③腸道菌群可以通過改善腸道健康來促進鈣的吸收和利用。維生素D是維持骨內穩態的重要物質之一[37],當體內鈣攝入不足時,腸道菌群中的細菌可以產生活性維生素D,從而促進腸道對鈣的吸收[38]。腸道菌群對于腸道黏膜的健康和完整性至關重要,它們可以幫助維持腸道屏障的完整性,預防腸道炎癥和滲漏。當腸道屏障受損時,會導致腸道對鈣的吸收和利用降低,從而影響骨內穩態[39]。

盡管有大量臨床研究表明腸道菌群失調與骨質流失存在相關性,但這可能只是骨質疏松患者的臨床體征,并不能表明腸道菌群與骨密度之間存在因聯系。首先,正如前文所說RCT可能受到混雜因素和反向因果等因素影響,同時部分研究結果是通過動物實驗獲得的,與人體內腸道菌群的構成存在差異,這些影響結果的可信度。其次,由于不同研究中受試者性別比例、環境、種族和飲食結構的不一致,可能導致腸道菌群的組成存在差異而影響到研究結果的準確性。最后,盡管有研究表明骨質疏松癥患者存在腸道菌群失衡的表型,但對于特定菌株變化的結果并不一致。這些不確定因素的存在阻礙對腸道菌群與骨質疏松癥風險之間因果關系的推斷。本研究與以往觀察性研究不同的是利用孟德爾隨機化研究為證明“腸-骨”軸理論提供了一種新的方法。一方面,孟德爾隨機化研究減少了混雜因素與反向因果的影響,極大地提高了研究結果的準確性;另一方面,在研究者方面筆者主要使用歐洲人群數據,將研究參與者限制為歐洲血統,能夠最大程度減少環境、種族和飲食結構等差異造成的結果偏倚。最重要的是,腸道微生物群的遺傳變異是從最大的可用GWAS薈萃分析中獲得的,這種大樣本量優勢確保了MR分析中IVs的強度以及研究結果的穩健性。

雖然本研究提供了有價值的見解,但這項研究也存在一些局限性,在解釋結果時應注意。首先,孟德爾隨機化通常僅考慮一個或兩個變量。但實際情況往往非常復雜,還可能有其他變量或交互作用會影響實驗結果。其次,本研究使用的全基因組關聯研究匯總數據庫并缺乏個體層面數據,限制了進行按年齡、性別、疾病持續時間、治療和疾病類型等變量進行亞組分析的能力。這使得在亞組之間比較因果效應的差異變得困難。因此,孟德爾隨機化雖然是一種常用的實驗設計方法,但也有其局限性。在實際應用中,需要結合實際情況,綜合考慮多種因素,以確保實驗結果的可靠性。

綜上所述,本研究采用了孟德爾隨機化分析來探討腸道菌群與骨密度之間的因果關系。研究結果顯示二者存在因果聯系,提示在臨床骨質疏松癥治療中需關注對腸道菌群的調節。