白色念珠菌鑒定方法學(xué)比較及流行病學(xué)研究

陳 瑤 鄭才斌

福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建南平 353000

白色念珠菌（Candida albicans）是一種常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌，常寄生在正常人的皮膚表面、口腔、胃腸道、陰道黏膜等位置而不發(fā)生疾病[1-2]。近年來(lái)，由于社會(huì)老齡化問(wèn)題愈來(lái)愈嚴(yán)重、多種廣譜抗生素的濫用、人體免疫功能下降等原因，導(dǎo)致感染白色念珠菌的人數(shù)逐年升高[3-4]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌是真菌感染常見(jiàn)致病菌，同時(shí)也是導(dǎo)致院內(nèi)獲得性念珠菌感染的主要病原體[5-6]。目前有很多方法可用于鑒定白色念珠菌[7-8]，包括基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser-desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析方法。MALDI-TOF MS 作為一種新興的微生物蛋白圖譜鑒定系統(tǒng)，因其具有快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)逐漸受到廣泛關(guān)注[9]。分析比較不同科室分離的白色念珠菌的親緣關(guān)系，可以清楚的看出它的傳播特點(diǎn)和流行情況，為有效抑制真菌擴(kuò)散與感染爆發(fā)提供依據(jù)。因此，準(zhǔn)確、快速地診斷念珠菌感染以及對(duì)其進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)于預(yù)防和治療侵襲性真菌感染具有重要的臨床價(jià)值。本研究通過(guò)回顧性分析2011 年1 月至2016年12 月臨床無(wú)菌部位分離的白色念珠菌，分別用不同方法鑒定并進(jìn)行比較分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

回顧性分析2011 年1 月至2016 年12 月福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院從臨床無(wú)菌部位（血液、腦脊液、胸腹水、穿刺液、引流液等）分離出的173 株白色念珠菌，均為各個(gè)科室送檢的血培養(yǎng)陽(yáng)性念菌株；均進(jìn)行同樣的方式檢驗(yàn)；將同一患者同一部位檢出的標(biāo)本或者同一患者不同部位反復(fù)檢出的相同標(biāo)本剔除，記錄好患者的基本資料和菌株信息。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 將收集到的菌株進(jìn)行復(fù)蘇，沙保羅瓊脂平板在35℃孵育箱培養(yǎng)24 ～48 h，挑選菌落進(jìn)行MALDI-TOF MS（德國(guó)布魯克公司）鑒定和ITS 測(cè)序鑒定。

1.2.2 同源性分析

1.2.2.1 多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST） （1）引物合成：從http://www.mlst.net/網(wǎng)站中獲取7 個(gè)管家基因位點(diǎn)的引物信息，委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

表1 白色念珠菌7個(gè)管家基因的片段長(zhǎng)度和引物序列

用以上引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，并行瓊脂糖凝膠電泳，再將擴(kuò)增后的陽(yáng)性產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，就可得到菌株的序列型（sequence typing，ST 型）和基因位點(diǎn)分型。

（2）系統(tǒng)發(fā)育分析：①基于位點(diǎn)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析。用clustalX 軟件，將上述測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，然后用MEGA4 軟件進(jìn)行菌株的序列多重比對(duì)，最后用鄰接法、最大簡(jiǎn)約法等構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。②基于位點(diǎn)型別的系統(tǒng)發(fā)育分析。用eBURST 的方法，將上述得到的7 個(gè)管家基因的基因位點(diǎn)型別進(jìn)行聚類(lèi)分析，至少有4 個(gè)基因位點(diǎn)相同的型別可分到同一eBURST 群中。

1.2.2.2 MALDI Biotyper 同源性分析 （1）聚類(lèi)分析[主譜圖預(yù)測(cè)（main spectra projection，MSP）]：125 株菌株可以生成125 個(gè)MSP，Selected MSP 窗口下選中全部MSP，右擊MSP Dendrogram，即可生成聚類(lèi)分析圖。

（2）主成分分析（principal compontent analysis，PCA）：分析菌株的原始數(shù)據(jù)，結(jié)果用View Clustering 圖形顯示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，用χ2檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITS測(cè)序結(jié)果

通過(guò)ITS 測(cè)序鑒定后，173 株白色念珠菌只有125 株鑒定準(zhǔn)確，PCR 電泳圖見(jiàn)圖1。

2.2 不同鑒定方法的結(jié)果比對(duì)

通過(guò)不同方法鑒定后，173 株白色念珠菌只有125 株鑒定準(zhǔn)確，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同鑒定方法的結(jié)果比較

2.3 白色念珠菌的菌株分布特征

用上述方法鑒定準(zhǔn)確的125 株白色念珠菌，分別來(lái)自125 例不同患者，男83 例（83/125，66.40%），女42 例（42/125，33.60%），年齡中位數(shù)為59 歲，平均（51.35±6.54）歲。引流液和血液是標(biāo)本來(lái)源中最多的兩種類(lèi)型，分別占43 例（43/125，34.40%）和40 例（40/125，32.00%），最少的為腦脊液（1/125，0.80%）?？剖曳植贾幸灾匕Y醫(yī)學(xué)科占最多有47 例（47/125，37.60%），排在第二的為基本外科占21 例（21/125，16.80%）。

2.4 MLST分型

125 株白色念珠菌經(jīng)MLST 分型后可得到61 個(gè)序列型（ST 型），其中最多的序列型為ST3160（8 株）和ST1474（9 株），其次是ST2059（7 株）和ST1450（7株）。在7 個(gè)管家基因位點(diǎn)中，VPS13 基因與SYA1基因依次分出24 個(gè)和19 個(gè)型別，分型效率居前兩位，ACC1 基因分出8 個(gè)型別，分型效率最低。

3 討論

多年來(lái)，深部真菌一直是院內(nèi)感染的關(guān)鍵致病微生物之一。對(duì)年齡分布的分析表明，60 ～79 歲年齡段的患者數(shù)量最多，占總數(shù)的一半以上，其中60 ～69 歲患者占比高達(dá)24.80%。這一趨勢(shì)與已有文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致[10-11]，強(qiáng)調(diào)了老年人更容易感染白色念珠菌的事實(shí)。這一現(xiàn)象可以追溯到多個(gè)因素：首先，老年人隨著年齡增長(zhǎng)，各個(gè)器官系統(tǒng)的功能逐漸減弱，是感染高發(fā)群體；其次，老年人通常伴隨多種基礎(chǔ)性疾病，可能服用影響免疫的藥物，或因住院時(shí)間較長(zhǎng)而接受侵入性操作，這些因素都導(dǎo)致免疫功能的下降，促使真菌在體內(nèi)滋生，引發(fā)二次感染[12]。值得特別強(qiáng)調(diào)的是，在本研究中，源自血液感染的白色念珠菌感染占比高達(dá)32.00%。根據(jù)報(bào)道[13]，真菌血癥病死率最高可超過(guò)70%，早期及時(shí)對(duì)疑似感染患者行真菌鏡檢及培養(yǎng)是挽救生命體的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)白色念珠菌感染的發(fā)病率在不同臨床科室之間存在差異，其中重癥醫(yī)學(xué)科的發(fā)病率最高，達(dá)到37.60%，這與先前的文獻(xiàn)報(bào)道[14]一致。在重癥醫(yī)學(xué)科，白色念珠菌高發(fā)的主要原因是醫(yī)源性因素，如氣管插管、中心靜脈導(dǎo)管的置入、留置導(dǎo)尿管等侵入性操作，外科大手術(shù)等。此外，基本外科科室中，肝膽外科檢出率也相對(duì)較高，通常伴隨創(chuàng)傷性大手術(shù)。因此，迫切需要尋找快速而準(zhǔn)確的鑒定方法，以便對(duì)真菌感染進(jìn)行診斷和治療。

本研究結(jié)果表明，針對(duì)致病性念珠菌的鑒定，MALDI-TOF MS 與ITS 測(cè)序結(jié)果相比，在準(zhǔn)確性上無(wú)明顯差異，但其具有更短的檢測(cè)時(shí)間和更低的成本，因此被視為一種迅速、便捷、精確的鑒定方法。有研究者認(rèn)為，真菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)存在技術(shù)局限，可能導(dǎo)致誤導(dǎo)性的鑒定和治療錯(cuò)誤。原因分析：①不同人對(duì)顏色的分辨能力存在差異，導(dǎo)致對(duì)于類(lèi)似的顏色，如紫紅色、藍(lán)色、藍(lán)灰色、藍(lán)紫色的識(shí)別存在差異；②常見(jiàn)菌株在科瑪嘉顯色后的顏色可能缺乏典型；③研究中所包含的不同菌種構(gòu)成比例不同；④少見(jiàn)與常見(jiàn)菌株的相似性。這反映了科瑪嘉顯色培養(yǎng)方法在結(jié)果解釋方面存在一定的主觀性，容易導(dǎo)致誤判情況的發(fā)生。因此，為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，需要將科瑪嘉顯色培養(yǎng)與其他鑒定方法結(jié)合使用[15-16]。

以MALDI-TOF MS 鑒定念珠菌，方法和原理完全有別于傳統(tǒng)方法，不再需要提取DNA 和測(cè)序。鑒別單個(gè)樣本所需的時(shí)間僅為幾分鐘，極大地提高了工作效率，成本低且操作簡(jiǎn)便。在本研究中，此法鑒定念珠菌級(jí)別準(zhǔn)確度高達(dá)100.00%，并且與ITS 測(cè)序結(jié)果完全一致。這一結(jié)果與已有文獻(xiàn)研究[17]的結(jié)論一致，肯定了此法鑒定精準(zhǔn)、低成本、高效率的特點(diǎn)。

分子生物學(xué)技術(shù)在臨床和科研領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，通常被視為評(píng)估其他真菌鑒定方法的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究通過(guò)ITS 測(cè)序準(zhǔn)確地確定了酵母樣真菌的種屬，覆蓋了12 個(gè)不同的真菌種類(lèi)。盡管分子生物學(xué)技術(shù)在真菌鑒定方面取得了顯著進(jìn)展，但仍存在一些挑戰(zhàn)。真菌基因數(shù)據(jù)庫(kù)尚不完善，同時(shí)，不同真菌DNA 提取尚缺乏統(tǒng)一規(guī)范，這可能導(dǎo)致較高的成本和較長(zhǎng)的操作時(shí)間。因此，許多臨床實(shí)驗(yàn)室目前尚未具備進(jìn)行這項(xiàng)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件，相關(guān)研究尚處于實(shí)驗(yàn)階段，尚未在臨床實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。

綜上，MALDI-TOF MS 鑒定念珠菌準(zhǔn)確度與ITS 測(cè)序相近，而且具有更高的效率、較低的成本，是一種快速、便捷、準(zhǔn)確的致病性念珠菌鑒定方法。此外，兩種方法的同源性分析結(jié)果基本一致，這表明在臨床實(shí)驗(yàn)室中廣泛采用MALDI-TOF MS 是合理的。然而，本研究也存在一些限制，包括樣本數(shù)量有限和研究時(shí)間較短。未來(lái)的深入研究將有助于更全面地驗(yàn)證MALDI-TOF MS 在念珠菌鑒定中的準(zhǔn)確度。