沙苑子總黃酮顯色條件及提取工藝優選研究

李 婷 汪小玉 稅丕先 張家偉 石厚銀 沈驊睿

1.西南醫科大學藥學院，四川瀘州 646000；2.西部醫藥技術轉移中心臨床研究部，四川成都 610041；3.四川奧邦古得藥業有限公司制劑部，四川成都 610000；4.西南醫科大學附屬中醫醫院骨傷科，四川瀘州 646000

沙苑子為豆科扁莖黃芪（Astragalus complanatusR.Br）的干燥成熟種子[1]，可補腎助陽、固精縮尿、養肝明目，常用于遺精早泄、腎虛腰痛、肝腎不足[2]。其主要成分有多糖、黃酮[3]、酚類[4]、甾醇類[5]等，黃酮類是其主要有效成分。藥理研究表明沙苑子總黃酮有抗腫瘤[6]、抗肝損傷[7]、抗炎[8]、抗疲勞、抗衰老[9]、免疫調節[10]等作用。本研究為提高總黃酮提取率，進一步開發利用沙苑子，以蘆丁為對照品，篩選NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法和AlCl3法兩種黃酮含量測定方法，比較不同脫脂、提取方法對總黃酮含量的影響，并采用單因素結合正交試驗的方法優選沙苑子總黃酮的最佳顯色條件及提取工藝，以期為其質量控制及后期開發和應用提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

沙苑子中藥飲片（產地：陜西，批號：180201-1）購自瀘州百草堂中藥飲片有限公司；蘆丁（純度：99.47%，批號：MUST-19010210）購自成都曼斯特生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV 1700PC 型紫外分光光度計（上海鳳凰光學儀器有限公司）；B843662903 型十萬分之一天平（上海梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司）；JOYN-10A型超聲機（上海喬躍電子科技有限公司）；RE20000B型旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 樣品及標準品溶液配置

沙苑子藥材105℃烘干后粉碎，稱取過40 目篩的粉末1 g 于圓底燒瓶中，加入80%乙醇30 ml，80℃提取2 h，提取2 次，合并提取液定容至100 ml 備用。精密稱取105℃下干燥至恒重的蘆丁標品5 mg 于50 ml 容量瓶中以60%乙醇定容，搖勻備用。

2.2 顯色方法考察

2.2.1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法 分別吸取2 ml 樣品和標準品溶液于25 ml 容量瓶中，分別加入0.3 ml 5%NaNO2溶液搖勻并靜置6 min、0.3 ml 10% Al（NO3）3溶液搖勻并靜置6 min、4 ml 4%的NaOH 溶液，蒸餾水定容，搖勻并靜置15 min。

2.2.2 AlCl3法 分別吸取樣品和標準品溶液0.8 ml于10 ml 容量瓶中，加入60%乙醇1.2 ml、2% AlCl3溶液0.8 ml、1 mol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖液1.2 ml，60%乙醇定容，搖勻，室溫下放置30 min。

紫外全波長掃描結果見圖1 ～2，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法僅蘆丁標準品在510 nm 處有最大吸收峰，樣品溶液無相同最大吸收峰；AlCl3法蘆丁標準品和樣品溶液在420 nm 處均有最大吸收峰。因此沙苑子總黃酮含量測定應采用AlCl3法。

圖1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法

2.3 顯色條件的優化

2.3.1 單因素考察 分別吸取樣品溶液0.8 ml，考察AlCl3溶液用量（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml），AlCl3溶液濃度（1%、2%、3%、4%），顯色時間（10、20、30、40 min），醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 值（3.6、4.5、5.4、7.0），醋酸-醋酸鈉緩沖液用量（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml）對總黃酮含量的影響。結果見圖3 ～7。

圖4 AlCl3 濃度的影響

圖5 時間的影響

圖6 醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 值的影響

圖7 醋酸-醋酸鈉緩沖液用量的影響

2.3.2 顯色條件正交試驗 選擇AlCl3用量（A）、AlCl3濃度（B）、顯色時間（C）、緩沖液用量（D）建立4因素3水平表，見表1。試驗結果及極差分析見表2。結果顯示，影響總黃酮含量的主次因素為D＞A＞B＞C，最佳顯色條件為A1B1C1D3，即2% AlCl30.6 ml，pH 4.5的緩沖液2.0 ml，室溫顯色20 min。3 次重復性實驗結果顯示吸光度平均值為0.934 L/（g·cm），RSD為1.16%，重復性良好。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗

2.4 標準曲線的繪制

精密吸取蘆丁溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6 ml于6 個10 ml 容量瓶中。以AlCl3法最優條件顯色，于420 nm 處測定吸光度。以蘆丁濃度和吸光度為橫、縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為：A=2.0586C+0.01（r=0.9996）。結果表明，蘆丁在40 ～160 μg/ml 范圍內線性關系良好。

2.5 提取方法考察

分別稱取石油醚脫脂后藥材粉末1 g 于3 個100 ml 圓底燒瓶，加入80% 乙醇20 ml（料液比1 ∶20）分別超聲提取、80℃溫浸、80℃回流提取1.5 h，抽濾，濾液備用。將3 種提取液分別顯色后，于420 nm 處測吸光度。結果見表3，其中以回流提取法提取沙苑子總黃酮最佳。

表3 沙苑子總黃酮的含量

2.6 提取條件的優化

2.6.1 提取單因素考察 準確稱取1 g 藥材粉末，考察不同乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%），提取溫度（50、60、70、80、90℃），提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h），料液比（10、15、20、25、30、35、40 g/ml），提取次數（1、2、3 次）對提取效率的影響。因素水平結果見表4。

表4 提取條件因素水平

2.6.2 提取工藝正交試驗 根據預實驗結果，以及各因素所取水平范圍，選定L9（34）正交表，對乙醇濃度（A），提取溫度（B），提取時間（C），料液比（D）4 個因素進行考察。正交試驗及方差分析見表5 ～6。結果表明，影響沙苑子總黃酮提取的4 個因素均有統計學意義，主次因素為C＞D＞B＞A，最佳提取條件為A1B3C3D1，即70%乙醇，85℃提取2 h，料液比1 ∶25（g/ml），提取2 次。

表5 提取條件正交試驗

表6 方差分析

2.7 驗證性實驗

為驗證最佳提取工藝的穩定性，進行3 次重復性實驗，見表7。結果顯示沙苑子平均總黃酮含量為24.50 mg/g，RSD＜2%，可知沙苑子總黃酮提取最佳工藝的重復性良好，該提取工藝合理且可行。

表7 驗證性試驗結果

3 討論

本實驗采用紫外-可見分光光度法，以單因素結合正交試驗法，考察了顯色及提取工藝對沙苑子總黃酮含量的影響。結果表明，AlCl3法適用于其含量測定，最佳顯色條件為0.8 ml 提取液加入1.2 ml 60% 乙醇，2% AlCl3溶液0.6 ml、pH 4.5 的醋酸-醋酸鈉緩沖液2 ml，60%乙醇定容至刻度，室溫靜置20 min。以回流提取法提取效果最佳，最佳工藝為70%乙醇85℃回流提取2 次，每次2 h，料液比1 ∶25（g/ml）。重復性較好，平均總黃酮含量RSD=1.87%，沙苑子總黃酮含量為24.50 mg/g。

目前黃酮的測定方法主要有比色法[11]、HPLC法[12]、薄層色譜法[13]等。NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法中，黃酮類物質先被NaNO2還原，再與Al（NO3）3生成螯合物，NaOH 使黃酮開環，溶液變為紅橙色[14]。蘆丁中有鄰二酚，3-、5-OH，AlCl3可與之螯合，形成穩定的絡合物，表現為黃色的顏色反應，在410 nm 左右有最大吸收[15]。經檢測，沙苑子黃酮與AlCl3反應在420 nm 處有最大吸收，可能與其黃酮中含有鄰二酚、3-和5-OH 等基團有關。紫外-可見分光光度法測定總黃酮含量具有操作簡單、測定快速、對儀器要求不高等優點。本研究方法操作簡便、可行性高，為沙苑子的進一步開發研究提供了實驗基礎。