基于網絡藥理學和分子對接探究柴胡清肝湯治療肉芽腫性乳腺炎的作用機制

謝 璐 萬 華 吳雪卿 馮佳梅 高晴倩 瞿文超 邵士珺 孫佳曄

上海中醫藥大學附屬曙光醫院乳腺科，上海 200021

肉芽腫性乳腺炎（granulomatous mastitis，GM）是非哺乳期乳腺炎常見的類型之一，臨床癥見乳房腫塊、紅腫、疼痛等，可伴有發熱、咳嗽、結節性紅斑、關節炎等全身癥狀，病情反復，病程遷延，好發于非哺乳期、非妊娠期的中青年女性[1-2]。近年來發病率逐年遞增，在全球其發病率占所有乳腺疾病的0.3%～1.9%，在發展中國家的發病率約占乳腺良性病變的4%～5%[3-5]。該病歸屬于中醫學“粉刺性乳癰”范疇，1985 年顧伯華教授首次明確提出該病的概念并收錄至《實用中醫外科學》[6]。

肝經郁熱證為該病常見的證型之一，臨床表現為乳房結塊紅腫熱痛、按之灼熱，或化膿潰破，可伴發熱、頭痛、便秘、溲黃，舌質紅、苔黃膩、脈弦數或滑數。《肉芽腫性小葉性乳腺炎中醫診療專家共識（2021 版）》[7]、“十三五”規劃教材《中醫外科學》[8]等均推薦柴胡清肝湯治療肝經郁熱證GM，治擬疏肝清熱、活血化瘀、調暢氣機。

臨床研究報道證實，柴胡清肝湯治療可顯著改善肝郁化熱型急性進展期GM 中醫證候評分，減輕乳房疼痛，縮小乳房腫塊，有效率較高[9]。現代藥理學研究表明，該方對肉芽組織增生有顯著的抑制作用[10]。但柴胡清肝湯治療GM 潛在的作用機制尚不明確，因此本研究運用網絡藥理學和分子對接的方法，探索該方的作用機制和潛在靶點，為臨床治療提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 柴胡清肝湯有效成分和相關靶點的篩選

在中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http: //tcmspw.com/tcmsp.php/）數據庫中，分別以柴胡清肝湯12 味中藥為關鍵詞進行檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（druglikeness，DL）≥0.18 作為限定條件，篩選得出該方的有效活性成分。運用Uniprot 數據庫（https: //sparql.uniprot.org/）對靶點蛋白轉化為標準名稱。

1.2 GM相關靶點的獲取及關鍵靶點的獲取

以“granulomatous mastitis”為關鍵詞在GeneCards（https: //www.genecards.org/）數據庫中檢索，獲取疾病相關靶點。將藥物有效成分靶點和疾病靶點導入Venny 2.1.0 繪制韋恩圖，得到柴胡清肝湯治療GM 的藥物-疾病關鍵靶點。

1.3 柴胡清肝湯治療GM靶點網絡構建

將藥物、有效成分、疾病相關靶點及其屬性文件數據導入Cytoscape 3.9.1 中，繪制柴胡清肝湯與GM 的成分-疾病-靶點網絡圖。

1.4 交集靶點的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建

將藥物-疾病交集靶點輸入STRING 數據庫（https: //www.string-db.org）中，選擇物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設定為“medium confidence（0.4）”，獲得PPI 網絡。將結果導入Cytoscape 3.9.1 中進行可視化處理。

1.5 GO富集和KEGG通路富集分析

將柴胡清肝湯治療GM 的交集靶點導入DAVID 數 據 庫（https: //david.ncifcrf.gov/），設置P＜ 0.05。GO 富集分析從生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MF）3 個模塊進行。將富集結果的條目繪制成條形圖和氣泡圖，由在線數據分析可視化平臺（https: //www.bioinformatics.com.cn/）繪制。

1.6 關鍵靶點的分子對接驗證

根據拓撲學參數Degree 值（度值）計算得出排名前5 位的核心活性成分，從TCMSP 數據下載MOL2 格式的3D 結構，將結構導入ChemBio3D Ultra 14.0 進行能量最小化；從PDB 數據庫下載核心蛋白基因的3D 結構，使用Pymol 2.3.0 進行去除蛋白結晶水、原始配體等操作，利用AutoDocktools（v1.5.6）對核心活性成分和關鍵靶點進行加氫、計算電荷等操作并保存為pdbqt 格式。使用POCASA 1.1 預測蛋白結合位點，采用AutoDock Vina 1.1.2 進行對接。利用PyMOL 2.3.0 和Ligplot V2.2.5 對對接結果進行相互作用模式分析，根據結合能大小評估化合物與核心蛋白靶點的結合活性，選取結合能≤-5.0 kJ/mol 作為篩選條件，以評價兩者的對接效果。

2 結果

2.1 柴胡清肝湯與GM作用靶點網絡分析

經過篩選共獲得柴胡清肝湯有效成分199個、有效成分靶點293 個、GM 疾病相關靶點79 個，其中有效成分和疾病交集靶點共23 個（圖1）。通過Cytoscape 3.9.1 構建柴胡清肝湯與GM 可視化網絡（圖2），利用Network Analyzer 進行PPI 拓撲學參數分析，共得到478 個節點、4374 條邊。以Degree值進行排序，藥物活性成分排名前5 位的分別是（圖3）：槲皮素（MOL000098，quercetin）、山柰酚（MOL000422，kaempferol）、β-谷甾醇（MOL000358，beta-sitosterol）、豆甾醇（MOL000449，stigmasterol）和黃芩素（MOL000173，wogonin），由此推測柴胡清肝湯可能通過以上有效成分在治療GM 中發揮關鍵作用。

圖1 柴胡清肝湯有效活性成分與GM 的交集靶點韋恩圖

圖2 柴胡清肝湯與GM 相互作用網絡圖

圖3 排名前5 位的柴胡清肝湯有效成分

2.2 柴胡清肝湯治療GM核心靶點分析及PPI網絡的構建

將23 個交集靶點導入STRING 數據庫進行PPI網絡分析，經篩選后得到23 個節點、163 條邊（圖4）。將結果導入Cytoscape 3.9.1 中，利用Network Analyzer進行PPI 拓撲學參數分析，以Degree 值排序，取排名前10 位的節點為核心靶點，即IL-6、TNF、ALB、IL-1β、CXCL8、STAT3、CCL2、IL-4、IFNG、CRP，并繪制可視化網絡圖（圖5），由此推測柴胡清肝湯作用于以上靶點發揮治療GM 的作用。

圖4 柴胡清肝湯治療GM 關鍵靶點PPI 網絡圖

2.3 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將23 個藥物-疾病交集靶點導入DAVID 數據庫中進行GO 富集分析，以P＜ 0.05 為篩選條件，BP 富集結果共129 個條目，CC 富集共9 個條目，MF 富集共13 個條目，根據Count 前10 位的富集結果作GO 功能富集分析圖（圖6）。結果顯示，BP 主要包括炎癥反應、基因表達的正向調控、對脂多糖的細胞反應、DNA 轉錄的正調控等；CC 主要包括細胞外空間、細胞外區域、外泌體、質膜等；MF 主要包括蛋白結合、相同蛋白質結合、細胞因子活性、酶結合、受體結合等。將Count 排名前15 位的KEGG核心通路構建KEGG 功能富集圖（圖7），主要包括IL-17、Toll 樣受體、細胞因子受體相互作用、NF-κB、TNF 等信號通路。

圖6 柴胡清肝湯治療GM 交集靶點的GO 功能富集圖

圖7 柴胡清肝湯治療GM 交集靶點的KEGG 通路富集圖

2.4 柴胡清肝湯主要有效成分與關鍵靶點的分子對接

根據網絡藥理學分析結果，篩選Degree 值排名前5 位的有效活性成分槲皮素（MOL000098，quercetin）、山柰酚（MOL000422，kaempferol）、β- 谷甾醇（MOL000358，beta-sitosterol）、豆甾醇（MOL000449，stigmasterol）和黃芩素（MOL000173，wogonin），及Degree 值較大的作用靶點IL-6（PDB ID：1ALU）、TNF（PDB ID：2E7A）、IL-1β（PDB ID：6I8Y）、CXCL8（PDB ID：6N2U）、STAT3（PDB ID：6NJ2）、IL-4（PDB ID：2D48），進行分子對接，取結合能力最高的對接結果進行可視化處理（圖8），結果顯示關鍵活性成分與核心靶點的結合能均≤-5.0 kJ/mol。

圖8 柴胡清肝湯有效活性成分與作用靶點的分子對接結果

3 討論

GM 是一類好發于非哺乳期、非妊娠期的慢性乳腺化膿性疾病，歸屬于中醫學“粉刺性乳癰”的范疇，病程遷延反復，復發率高，影響患者的身心健康和生活質量。目前，該病病因尚未明確，可能與自身免疫功能紊亂、細菌感染、乳頭凹陷、高泌乳素血癥等相關[11-13]。

肝經郁熱證為該病臨床最常見的證型之一，臨床常用柴胡清肝湯加減治療。柴胡清肝湯出自明代陳實功《外科正宗》，由柴胡、川芎、當歸、赤芍、生地黃、黃芩、山梔、天花粉、防風、牛蒡子、連翹、甘草共12 味藥物組成，諸藥配伍，以“清消”為貴，發揮疏肝解郁、清熱解毒、和營消腫的功效。現代藥理學研究證實柴胡清肝湯可通過抑制IL-6、IL-2、IL-4、TGF-β 等促炎因子的表達，作用于NLRP3/IL-1β 通路抑制GM 的炎癥發展[14]。

本研究基于網絡藥理學探究柴胡清肝湯治療GM 的潛在作用靶點，共獲得柴胡清肝湯有效活性成分199 個、有效成分靶點293 個、藥物-疾病共同靶點23 個，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素等有效活性物質可能作用于IL-6、TNF、ALB、IL-1β、CXCL8、STAT3、CCL2、IL-4、IFNG、CRP 等靶點，干預IL-17、Toll 樣受體、細胞因子受體相互作用、NF-κB、TNF 等信號通路。分子對接結果顯示，柴胡清肝湯中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等關鍵活性成分與核心靶點的結合能均≤-5.0 kJ/mol，驗證了運用網絡藥理學初步探索柴胡清肝湯治療GM 作用機制的可靠性。

GM 病理鏡下表現為肉芽腫周圍炎性細胞的致密集合[15]，免疫應答中起主要作用的是巨噬細胞，重要特征是單核/巨噬細胞的活化[16]。巨噬細胞具有高度的可塑性，暴露于不同的誘導環境時，功能上可極化為促炎性（M1）表型和修復性（M2）表型[17]。在炎癥病理情況下，乳腺微環境穩態喪失，平衡傾向于促炎，引起巨噬細胞表型向M1 型極化。結合本研究關鍵靶點PPI 網絡圖、GO 功能富集圖、KEGG 通路富集圖的研究結果，柴胡清肝湯可能通過多靶點、多通路作用于M1/M2 巨噬細胞表型極化，調節多種下游多種炎癥因子的表達，干預GM 的病程發展。

本研究運用網絡藥理學和分子對接的方法，從分子機制層面初步分析柴胡清肝湯治療GM 的主要有效成分和作用機制，結果顯示柴胡清肝湯可通過多成分、多靶點、多通路作用于GM 的疾病治療，潛在的作用機制可能與調節巨噬細胞功能相關，但缺乏實驗研究的驗證，后續將對具體機制行進一步的科學探索和驗證。