二甲雙胍通過AMPK/Sirt1信號通路延緩心肌細胞衰老

余 星 劉文熾 肖婧雯 張 彥

1.福建醫(yī)科大學附屬福州市第一醫(yī)院心內科，福建福州 350004；2.福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院創(chuàng)傷外科，福建福州 350004

衰老是生物體結構和功能隨著年齡的增長而下降的一種自然過程，心臟重量隨著年齡的增長而增加，而心肌細胞數(shù)量逐漸減少，這種功能性心臟細胞的持續(xù)喪失伴隨著再生活動的下降[1]。心肌細胞的衰老伴隨著心肌收縮力降低，自噬功能及抗應激能力不斷下降，最終引起心功能障礙[2-3]。近年來，延緩心肌細胞衰老作為預防心血管疾病的潛在靶點受到廣泛關注。二甲雙胍是治療2 型糖尿病的一線首選藥物[4]，其除了具有降糖作用外，在干預衰老的幾個關鍵通路中具有獨特的地位[5]，使用二甲雙胍可降低衰老相關疾?。òò┌Y和心血管疾病）的全因病死率[6]。Xia 等[7]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以通過抑制內皮細胞衰老，從而緩解5-氟尿嘧啶誘導的小鼠腸道損傷。AMP 活化蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK]是許多細胞途徑的關鍵調節(jié)因子，在防治衰老方面起著至關重要的作用。二甲雙胍可激活心肌細胞、肝細胞和骨骼肌細胞的AMPK，從而保護心血管。沉默信息調節(jié)劑2 相關酶1（sirtuin1，Sirt1）是一種NAD+依賴性脫乙酰酶，參與細胞周期調控、炎癥、自噬和衰老等大量生物過程，在預防人類各種疾病方面發(fā)揮著重大作用。但目前有關二甲雙胍是否對衰老心肌細胞具有保護作用及AMPK/Sirt1 在其中發(fā)揮的作用并無確切研究。本研究通過觀察潛在抗衰老藥物二甲雙胍對百草枯誘導的小鼠心肌細胞衰老的影響以及AMPK/Sirt1 信號通路在其中的作用，探討二甲雙胍的心臟保護作用，以期為心臟衰老的防治提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HL-1 心肌細胞系（武漢普諾賽科技公司）；二甲雙胍、β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技公司）；百草枯（阿拉丁公司）；活性氧檢測試劑盒（江蘇碧云天生物公司）；β-actin 抗體、Anti-AMPK 抗體、Anti-Sirt1 抗體（abcam 公司）。超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術有限公司）；流式細胞儀（BD 公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）；電泳槽（美國BioRad 公司）；化學發(fā)光儀（美國Thermo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HL-1 心肌細胞，培養(yǎng)條件為DMEM+10%FBS+1%P/S，置于5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 心肌細胞衰老模型的建立 心肌細胞在6孔板內生長至合適密度時，加入100 μmol/L 的百草枯（paraquat，PQ）培養(yǎng)72 h[8]。通過衰老相關β-半乳糖苷酶染色（senescence associated β-galactosidase，SA-β-Gal）[8]、活性氧（reactive oxygen species，ROS）活性[8]鑒定模型是否成功。

1.2.3 細胞分組與處理 細胞分組如下，①空白對照組（CK 組）：不做特殊處理；②百草枯組（PQ組）：心肌細胞暴露于100 μmol/L 的PQ；③二甲雙胍（metformin，MET）干預組（PQ+0.01/0.1/1/10 mM MET 組）：心肌細胞暴露于100 μmol/L 的PQ 中60 min，用含不同濃度的二甲雙胍（0.01、0.1、1、10 mmol/L）的培養(yǎng)處理10 d；④二甲雙胍聯(lián)合AMPK siRNA 干預組（PQ+0.1 mM MET+si-AMPK組）：HL-1 心肌細胞加用AMPK siRNA 處理1 h，于100 μmol/L 的PQ 中干預1 h，再用二甲雙胍0.1 mmol/L 處理10 d；⑤AMPK 沉默組（si-AMPK組）：構建AMPK 沉默載體（AMPK siRNA）并轉染心肌細胞；⑥轉染試劑對照組（mock 組）：用空載轉染心肌細胞；⑦陰性序列對照組（NC 組）：陰性對照轉染心肌細胞。

1.2.4 SA-β-Gal 細胞種于6 孔板中，用PBS 洗滌后加入1 ml 的SA-β-Gal 染色固定液，將固定液棄去后用PBS 清洗，同時在每孔中再加入1 ml 的SA-β-Gal 染色工作液，封口膜封住6 孔板，將培養(yǎng)板放置于恒溫箱中孵育過夜。染色結束之后于普通光學顯微鏡下觀察，并計算細胞衰老率。

1.2.5 ROS 水平檢測 根據(jù)試劑說明，本研究采用流式法測定細胞內ROS 水平，并按照之前的實驗方法來操作[8]。

1.2.6 蛋白質印跡法（Western blot，WB） 處理后的細胞用RIPA 緩沖液充分裂解，4℃12 000 g 離心15 min 得到總蛋白，使用BCA 蛋白質測定試劑盒定量蛋白質濃度，電泳后轉移到PVDF 膜上，使用5% 脫脂牛奶封閉1 h，封閉完后將膜放入裝有一抗的抗體雜交盒中，4℃孵育過夜。TBST 洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗膜后，加ECL 試劑進行顯色、曝光，并使用Image J 軟件進行定量。

1.2.7 RNA 干擾 AMPK siRNA 序列：正義鏈為5’-GCAGAAGUAUGUAGAGCAATT-3’，反義鏈為5’-T T G C T C T A C A T A C T T C T G C T T-3’，陰性對照（negative control，NC）序列：正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGTGACACGTTCGGAGAATT-3’，RNA 干擾參照既往方法進行[8]。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 7.0 軟件分析結果并繪制統(tǒng)計圖，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，三組及以上比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，P＜ 0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍減輕百草枯誘導的心肌細胞衰老及最適濃度篩選

與CK 組比較，100 μmol/L 百草枯干預心肌細胞72 h 后能增加細胞衰老率及ROS 水平，不同濃度二甲雙胍均可降低百草枯誘導的心肌細胞衰老率（圖1A）及ROS（圖1B），以0.1 mmol/L 濃度時差異最為顯著，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），因此選擇0.1 mmol/L 作為二甲雙胍的最適濃度用于后續(xù)實驗。

圖1 二甲雙胍對心肌細胞衰老的影響及最適濃度篩選

2.2 二甲雙胍對AMPK、Sirt1蛋白表達的影響

WB 檢測發(fā)現(xiàn)PQ 誘導的心肌細胞內AMPK、Sirt1 蛋白表達下降，而經(jīng)過二甲雙胍預處理能夠部分逆轉AMPK 和Sirt1 蛋白表達的下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），見圖2。

圖2 二甲雙胍對AMPK、Sirt1 蛋白表達的影響

2.3 AMPK siRNA對AMPK、Sirt1蛋白表達的影響

與轉染試劑對照組（mock 組）比較，陰性序列對照組（NC 組）AMPK、Sirt1 表達水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。而與NC 組比較，AMPK 沉默組（si-AMPK）AMPK 蛋白表達明顯減少，同時Sirt1 表達也顯著減少，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），見圖3。

圖3 AMPK siRNA 對AMPK、Sirt1 蛋白表達的影響

2.4 AMPK siRNA顯著抵消二甲雙胍改善心肌細胞衰老作用

PQ+0.1 mM MET+si-AMPK 組Sirt1 蛋白表達較二甲雙胍干預組明顯降低（圖4）；且細胞衰老陽性細胞比例（圖5A）及ROS 活性（圖5B）較二甲雙胍干預組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），但與PQ 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見圖5。

圖4 AMPK siRNA 顯著抵消二甲雙胍改善心肌細胞衰老作用

圖5 抑制AMPK 表達和二甲雙胍處理對細胞衰老的影響

3 討論

本研究結果顯示，百草枯能成功誘導小鼠心肌細胞衰老，而不同濃度二甲雙胍通過調控AMPK/Sirt1 信號通路很大程度上延緩百草枯誘導的細胞衰老。

構建細胞衰老模型的方法較多，有自然衰老模型、D-半乳糖、過氧化氫及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導模型等，其中百草枯誘導衰老模型[8]容易操作，結果較穩(wěn)定。故本研究采用百草枯干預心肌細胞，結果發(fā)現(xiàn)細胞衰老陽性比例和ROS 水平增加，這與公認的細胞衰老特征一致，表明心肌細胞衰老模型構建成功。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍具有獨立于降糖作用外的抗細胞衰老作用，二甲雙胍可通過抑制胰島素樣生長因子（insulinlike growth factors -1，IGF-1）介導的磷酸酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信號通路來延緩2BS 細胞衰老[9]；同時，二甲雙胍通過蛋白磷酸酶2/蛋白激酶B 通路誘導結直腸癌細胞衰老，從而抑制結直腸癌細胞增殖[10]，為腫瘤的治療提供了一定思路；本研究也發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能明顯降低心肌細胞衰老率及ROS 水平，提示二甲雙胍能抵抗小鼠心肌細胞衰老。

AMPK 的激活可減少與衰老相關的SA-β-Gal 細胞陽性率，恢復血管平滑肌細胞的增殖，是防治衰老的一個潛在靶標。二甲雙胍通過磷酸化催化α 亞基上的關鍵調節(jié)位點來誘導AMPK 活化，抑制核因子κB 信號傳導并減輕細胞炎癥[11]。同時二甲雙胍抑制IGF-1 信號傳導，導致胰島素水平降低，這些共同抑制炎癥和自噬，有利于拮抗衰老過程[12]。Sirt1 是一種NAD+依賴性脫乙酰酶，能抵抗氧化應激、炎癥和心血管衰老。研究表明，Sirt1的表達隨著小鼠年齡的增長而減少，當過表達Sirt1時，心肌肥大、氧化應激等相關衰老標志物下降[13]；當Sirt1 缺乏時，p53 乙?；e累增多，從而增強氧化應激誘導的細胞衰老[14]。研究指出，AMPK 依賴細胞內NAD+水平升高而激活Sirt1，二者相互調節(jié)，共享許多靶分子[15]。本研究發(fā)現(xiàn)百草枯在誘導HL-1 心肌細胞衰老過程中，AMPK 和Sirt1 表達水平顯著下降；經(jīng)二甲雙胍處理后，AMPK 和Sirt1 蛋白的表達上調；值得注意的是，在AMPK 抑制后，二甲雙胍的有益作用不再可見。

綜上所述，本研究提示在百草枯誘導的HL-1心肌細胞衰老模型中，二甲雙胍可能通過上調AMPK、增加Sirt1 表達而延緩衰老。但本研究為體外實驗，尚不能準確反映在體內的情況，有待后續(xù)進一步的動物實驗來深入研究。