基于雙光譜顯微成像技術(shù)的赤潮藻類分類識別

畢曉琳，蔣靖雯，張芷悠

（廣東東軟學(xué)院，廣東 佛山 528225）

1 前言

隨著社會經(jīng)濟(jì)和工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，水體中排入了大量的氮、磷等，由此導(dǎo)致了水體的富營養(yǎng)化，產(chǎn)生赤潮問題。研究鑒別各類赤潮藻類，實(shí)施針對性用藥，是赤潮監(jiān)測與防治的關(guān)鍵。

目前，國內(nèi)外對于藻類的鑒別和檢測的方法有許多種，但多是采用化學(xué)檢測方法，該類化學(xué)檢測方法在藻類鑒別中有較高的準(zhǔn)確率，但是實(shí)驗(yàn)過程會損壞樣品，不能進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)連續(xù)觀察，且不能在混合狀態(tài)下鑒別出單種藻類。

高光譜成像技術(shù)具有快速、無損、高效、準(zhǔn)確預(yù)測等特點(diǎn)，近年來，在很多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。例如，血液細(xì)胞的識別[1]、馬鈴薯營養(yǎng)成分檢測[2]、癌細(xì)胞鑒別[3]、花粉鑒別[4]等。因?yàn)榫哂心軌蛲瑫r獲得樣品的形貌信息和光譜信息的特性，高光譜成像技術(shù)成為生物檢測領(lǐng)域的重要手段之一，在藻類鑒別領(lǐng)域也有實(shí)踐，例如赤潮藻的圖像自動識別[5]，現(xiàn)有的高光譜成像技術(shù)在藻類的應(yīng)用中，僅依靠藻類的吸收光譜信息來進(jìn)行種類鑒別，部分藻類體內(nèi)的色素種類與含量十分相近，僅用吸收光譜難以準(zhǔn)確鑒別，考慮到藻類體內(nèi)富含一些熒光物質(zhì)，本研究提出同時獲取吸收光譜和熒光光譜的雙光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)藻類的鑒別的方法。通過自主搭建的雙光譜顯微系統(tǒng)同時獲取中肋骨條藻、赤潮異彎藻、球形棕囊藻的熒光光譜和吸收光譜進(jìn)行鑒別，并且充分發(fā)揮成像技術(shù)的可視化優(yōu)勢，進(jìn)行后續(xù)的二值化、濾波等圖像處理，得以直觀地觀察到混合樣本中各種藻類的分布與數(shù)量等信息。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 樣本

試驗(yàn)所采用的赤潮異彎藻、中肋骨條藻和球形棕囊藻以及配套的培養(yǎng)液采集于上海光語生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件為25 攝氏度，光照3500lux，光照12 小時。

2.2 吸收光譜與熒光光譜數(shù)據(jù)采集

2.2.1 雙光譜顯微成像系統(tǒng)

自主設(shè)計搭建的雙光譜顯微成像系統(tǒng)如圖1 所示，該系統(tǒng)可同時獲取樣品的吸收光譜與熒光光譜，系統(tǒng)主要包括40 倍無限遠(yuǎn)校正顯微物鏡、管透鏡、液晶可調(diào)諧濾波器（LCTF，CRI 公司，ValISPEC VIS）和16 位灰度CMOS傳感器（CMOS，HAMAMATSU Inc.,ORCA-Flash4.0 LT C11440-42U），另外，系統(tǒng)中設(shè)置了一個寬光帶鹵鎢燈作為發(fā)射光源和一個組裝361nm 窄帶濾波片的氙燈作為熒光激發(fā)光分別用于吸收光譜和熒光光譜獲取。此外，系統(tǒng)設(shè)置一個截止波長為425nm的二向分色鏡（TRALASS Inc.，DMLP425R）來分離激發(fā)光和信號光。相對應(yīng)的軟件系統(tǒng)包含一個控制程序和一個數(shù)據(jù)處理程序，該控制程序用于協(xié)調(diào)CMOS 與LCTF，實(shí)現(xiàn)波長掃描。數(shù)據(jù)處理程序用于分析處理光譜數(shù)據(jù)以及建模判別。

圖1 雙光譜顯微成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

2.2.2 吸收光譜與熒光光譜獲取

將藻類樣本置于高光譜顯微成像系統(tǒng)移動平臺上，寬帶發(fā)射光穿過樣品時，一部分光將被樣品吸收，剩余部分出射光將攜帶樣品的吸收光譜信息被CMOS 探測。吸收率定義為以下方程，由此得到吸收率信息。

A(λ)代表λ波長下的吸收率。由于像素灰度值與光強(qiáng)度成正比，I(λ)sample和I(λ)background分別代表樣本像素點(diǎn)和背景像素點(diǎn)在λ波長下的灰度值。

作為短波長的輻射，組裝361nm 窄帶濾波片的氙燈光源很輕易能夠激發(fā)藻類的熒光。熒光依次通過二向色反射鏡和LCTF 被CMOS 探測到，從而得到藻類的熒光光譜。為了消除激發(fā)光強(qiáng)度的影響，熒光強(qiáng)度在處理前先進(jìn)行如下歸一化處理：

In(λ)代表λ波長下像素點(diǎn)的歸一化強(qiáng)度，I(λ)代表在λ波長下的像素點(diǎn)的灰度值。Iλ-max表示該像素點(diǎn)在波長范圍為460nm 至660nm 內(nèi)的灰度值最大值。

在該實(shí)驗(yàn)中，以2nm 為步進(jìn)波長獲取了460nm 至660nm 光譜范圍三種藻類的吸收光譜與熒光光譜圖像。由于赤潮異彎藻和球形棕囊藻沒有熒光或熒光極弱，對應(yīng)的歸一化熒光強(qiáng)度曲線信噪比極低，沒有特定的波峰波谷。

3 結(jié)果與分析

3.1 基于吸收譜建立Fisher 分類模型

該實(shí)驗(yàn)中，訓(xùn)練集為900 個單種藻類的吸收光譜數(shù)據(jù)（每種300 個），用于訓(xùn)練Fisher 分類模型[6]，測試集為300 個單種藻類的吸收光譜數(shù)據(jù)（每種100 個）用于測試模型的準(zhǔn)確率，判別準(zhǔn)確率的定義如下式：

AC代表模型的判別準(zhǔn)確率，NRight代表正確分類的樣本個數(shù)，NTotal代表試測樣集樣本總數(shù)。

此外，使用判別靈敏度（SEN）和特異性（SPEC）評估模型的分類性能。

Fisher 分類模型的檢驗(yàn)結(jié)果如表1，吸收光譜模型的判別準(zhǔn)確率為98%。結(jié)果表明，三種微藻的SPEC和SEN 均達(dá)到95%以上，證明使用該分類模型鑒別這三種藻類是可行的。

表1 基于吸收譜的Fisher 分類模型的判別結(jié)果

根據(jù)觀察，中肋骨條藻有熒光，而赤潮異彎藻和球形棕囊藻沒有觀察到熒光，因此結(jié)合中肋骨條藻的熒光光譜和上文提及的吸收光譜作為判別依據(jù)，重新訓(xùn)練Fisher 分類模型進(jìn)行判別，判別結(jié)果如表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)合熒光光譜信息，可以保證中肋骨條藻百分百的判別準(zhǔn)確率，三種藻類判別準(zhǔn)確率為99%。

表2 基于雙光譜的Fisher 分類模型的判別結(jié)果

3.2 混合樣品的判別以及可視化處理

基于藻類的雙光譜數(shù)據(jù)建立具有較高靈敏度和特異性的模型后,采用該模型對三種藻類混合的樣本進(jìn)行鑒別，并將結(jié)果可視化處理，處理流程如下：首先將混合藻類圖像進(jìn)行二值化處理，由于吸收光譜圖片的光場與視場不統(tǒng)一，單閾值的二值化圖片結(jié)果往往不理想，會損失許多藻類像素點(diǎn)。為了提高圖片的信噪比，采用分割多閾值的方法，混合樣品光譜圖片的大小為256*256 像素，圖片將被均勻分割成1024 個8*8 像素的方形區(qū)域，在方形區(qū)域內(nèi)取自適應(yīng)閾值。為了提升混合樣本圖像質(zhì)量，去除噪點(diǎn)，采用低通濾波器對二值化后的圖進(jìn)行濾波。

濾波處理完成后，獲取圖片中所有藻類的像素點(diǎn)的位置信息、熒光光譜和吸收光譜信息，使用基于雙光譜的fisher 分類模型進(jìn)行鑒別，根據(jù)分類結(jié)果用不同的灰度值標(biāo)識像素點(diǎn)，將不同灰度值的像素點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的偽彩圖。由于藻類的大小接近衍射極限，藻類邊緣會容易出現(xiàn)錯判的像素點(diǎn)，對此應(yīng)用聯(lián)通區(qū)域標(biāo)記算法[7]結(jié)合藻類的形態(tài)信息去校正這些錯判的像素點(diǎn)，應(yīng)用聯(lián)通區(qū)域標(biāo)記算法后，被錯判藻類像素點(diǎn)得到校正，優(yōu)化了判別結(jié)果，經(jīng)過一系列的圖像處理方法，可以直觀地觀察到三種藻類的分布以及數(shù)量。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于高光譜顯微成像技術(shù)對中肋骨條藻，赤潮異彎藻和球形棕囊藻三種藻類樣本進(jìn)行判別分析，通過吸收光譜和熒光光譜的雙光譜技術(shù)提高判別準(zhǔn)確率。基于Fisher 分類算法建立模型，結(jié)合雙光譜信息，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，僅使用吸收光譜進(jìn)行建模判別，判別準(zhǔn)確率僅為98%，結(jié)合熒光光譜信息能夠提高判別準(zhǔn)確率。通過一系列的圖像處理方法，能夠?qū)⑴袆e結(jié)果可視化處理，直觀觀察不同種類藻類的數(shù)量與分布，在今后研究中將考慮改變不同環(huán)境因素如pH、溫度等，研究環(huán)境條件的改變對混合藻類的生存競爭影響，為赤潮藻類防治針對性用藥提供理論參考。