人類皰疹病毒4感染對宮頸癌影響的Meta分析和臨床研究

陸建橋,曹廣旭,李 芳*,高金莉

(1.同濟大學醫(yī)學院附屬東方醫(yī)院婦產(chǎn)科,上海 200120;2.同濟大學附屬東方醫(yī)院病理科,上海 200120)

宮頸癌是女性最常見的癌癥之一,是繼乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌之后的第4大常見的惡性腫瘤,也是女性癌癥死亡的第4大原因。影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展以及生存率的原因有很多,已經(jīng)證實持續(xù)的人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染是宮頸癌的病因[1],其他病毒感染在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用強度和作用機制的研究相對較少。

有研究表明,部分宮頸癌變組織中可同時檢出人類皰疹病毒4(Epstein-Barr virus,EBV)和HPV[2-3],進一步的研究結(jié)果顯示宮頸EBV和高危HPV合并感染的女性其宮頸細胞學異常的風險比單純高危HPV陽性的女性增加了約4倍[4],且隨疾病進展病毒載量有增加的趨勢[5],提示EBV可能是宮頸癌進展的促進因素。但O’Leary等[6]、Aromseree等[7]、Seo[8]等報告在癌變細胞中未檢出EBV,并由此認為EBV在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中無作用或只起到輔助作用。隨著宮頸癌病例中EBV檢測數(shù)據(jù)的不斷積累,再次回顧其感染與宮頸癌之間的相關(guān)性,有助于對EBV致病性及其與HPV協(xié)同作用的理解。

已往的研究表明,包括宮頸癌在內(nèi)的許多癌癥病患中,EBV感染率具有地域差異[9-10]。上海地區(qū)宮頸癌患者中的EBV感染率及其與HPV共感染對癌癥發(fā)生發(fā)展的影響尚不清楚,有必要對此開展研究,為本地區(qū)宮頸疾病預防提供依據(jù)。本研究通過Meta分析和臨床研究,旨在明確EBV感染對宮頸癌,尤其對本地人群宮頸癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 資料與方法

1.1 Meta分析

1.1.1 文獻數(shù)據(jù)提取 文獻資料從PubMed、Web of Science中檢索而得,使用了Herpesvirus 4 or Human or Burkitt Lymphoma Virus or Lymphoma Virus or HHV-4 or EBV和Uterine Cervical Neopla-sms or Cervical Neoplasm,Cervix or Cancer of the Uterine Cervix兩組檢索詞,檢索方式是在主題、篇名、關(guān)鍵詞和摘要中模糊檢索,設(shè)置的時間范圍為1990年9月1日—2022年9月1日。同時,采用跟蹤檢索法對感興趣的文獻的參考文獻進行篩選。文獻資料納入規(guī)則:標題或摘要中至少有一個關(guān)鍵詞,并顯示了EBV和宮頸腫瘤之間的關(guān)系;病患年齡≥18歲。文獻資料排除規(guī)則:沒有明確采用某種方法檢測EBV;基于動物或模型的實驗報告;觀察性研究、評論、信件、社論、會議摘要、作者的回復和病例報告、非英文報告等。剔除重復的檢索結(jié)果。從文獻中提取以下信息:第一作者、出版年份、國家、患者總數(shù)、檢測方法、標本類型、病理結(jié)果等。所有關(guān)于數(shù)據(jù)提取的差異都通過與共同作者達成共識來解決。每項研究的質(zhì)量都由評審員用Cochrane偏倚風險工具獨立評估。

1.1.2 統(tǒng)計分析 用Stata 12和Review Manager(RevMan 5.4版)軟件進行統(tǒng)計分析。先計算每項研究的EBV感染率和置信區(qū)間(Confidence Interval,CI),再進行Meta分析以評估總體EBV感染率,最后進行亞組分析,包括病理組織學類型及標本類型2類亞組。統(tǒng)計學異質(zhì)性用χ2檢驗和I2統(tǒng)計評估,χ2檢驗中P<0.05為存在顯著性,I2在50%以上定義為異質(zhì)性顯著。當研究間的異質(zhì)性不顯著時,采用固定效應模型;當異質(zhì)性顯著時,采用隨機模型。效應量分別選擇影響大小(effect size,ES)[95%CI]和累積風險比(risk ratio,RR)[95%CI],ES的百分率視為感染率。所有的測試都是雙邊的。

1.2 臨床研究

在獲得每位患者的知情同意的前提下,收集同濟大學附屬東方醫(yī)院2021—2022年門診及住院且經(jīng)HPV篩查的患者所有就診信息,選擇其中可用的宮頸癌(squamous carcinoma of the cervix,SCC)及宮頸上皮內(nèi)病變(squamous intraepi-thelial lesion,SIL)的石蠟包埋組織塊,對組織樣本行原位雜交免疫組織化學染色法檢查EBV編碼的小RNA(epstein-Barr encoded RNA,EBER)。常規(guī)待測石蠟組織切片3 μm,貼片于帶陽性對照的防脫片上,于65 ℃烤箱烤60 min,在已設(shè)置好染色程序的自動免疫組化儀(北京中杉金橋Ultra PATH)上進行染色。試劑盒為北京中杉金橋EBER地高辛染色液試劑盒ISH-7001UM。收集我院行手術(shù)治療且病理類型明確的宮頸疾病患者就診信息,采集空腹血2 mL,用淋巴細胞分離液分離沉淀白細胞,采用新產(chǎn)業(yè)生物科技公司生產(chǎn)的全自動化學發(fā)光分析儀及其配套試劑盒檢測EBV 4項抗體:衣殼抗原(VCA)-IgM、VCA-IgG、早期抗原(EA)-IgG、核抗原(NA)-IgG。以EA-IgG抗體陽性作為反映近期有EBV感染,且病毒活躍增殖的指標,以VCA-IgM判斷現(xiàn)癥感染率,以NA-IgG判斷既往感染率[11]。同時根據(jù)4項抗體陽性概貌,參照文獻[12-13]的方法,對EBV感染狀態(tài)進行聯(lián)合判斷。

2 結(jié) 果

2.1 Meta分析結(jié)果

2.1.1 文獻篩選流程和結(jié)果 從PubMed和Web of Science中初步檢索出4 663篇文獻,剔除重復和不相關(guān)的文獻后,共入選796篇,文獻篩選流程見圖1。在對標題和摘要進行篩選后,共入選28篇文獻。對28篇文獻進行全文審查,最終共有16篇文獻納入本研究。納入的文獻發(fā)表于1997—2021年,包括了2 199例患者,單純HPV陽性共616例,單純EBV陽性共288例,雙陽性356例,雙陰性936例?；颊咧杏?39例SIL,264例SCC,其中兩項研究中的60例宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變未明確劃分高級別和低級別,亞組分析時未納入統(tǒng)計范圍。經(jīng)評估,無偏倚風險,見圖2。

圖1 文獻檢索流程圖

圖2 文獻質(zhì)量風險評估

16項研究中有6項在亞洲[5,7,14-17],3項在歐洲[2,18-19],5項在美洲[4,20-23],2項在非洲[3,24]。考慮到組織樣本的來源可能影響病毒的檢出率,本研究對樣本來源進行了分類:3項研究樣本來源為宮頸拭子,5項為活檢組織樣本,6項為細胞學樣本,2項為冷凍樣本。所有文獻都使用了PCR技術(shù)檢測EBV,只有1項同時使用了ISH技術(shù)[16,19]。

納入文獻及提取的基本信息見表1。

表1 文獻數(shù)據(jù)信息表

圖3 不同類型患者單純EBV感染率

圖4 不同類型患者EBV和HPV共感染率

圖5 不同類型患者EBV和HPV合并感染率與HPV單純感染風險比

2.2 臨床樣本檢測結(jié)果

共收集到40例患者的組織塊行EBER檢測,包括10例宮頸癌患者,30例HSIL,均為高危型HPV感染。EBER檢測結(jié)果表明,所有樣本均為EBER陰性。

30例臨床病例類型及EBV抗體的檢測結(jié)果見表2。病例中包括4例SCC患者、24例HSIL、2例LSIL患者。24例患者的EA-IgG,陽率性為12%(3/24),均屬于HSIL患者。26例患者的VCA IgG,陽性率為92%(24/26),4例為SCC患者,20例為HSIL患者。30例患者中有7例VCA-IgM陽性(暗示現(xiàn)癥感染),陽性率為23%(7/30),其中6例為HSIL患者,即HSIL中陽性率為25%(6/24)。LSIL患者中VCA-IgM陽性率為50%(1/2),SCC患者陽性率為0(0/4)。27例患者中NA-IgG陽性的24例,占89%(24/27),SCC、HSIL和LSIL患者中陽性率分別為100%(4/4)、86%(18/21)和100%(2/2)。

表2 臨床樣本EBV抗體檢測結(jié)果及由此判斷的感染狀態(tài)

20例患者的4項抗體檢測數(shù)據(jù)齊全,包括4例SCC患者,16例HSIL患者。沒有患者4種抗體均為陽性。由4項抗體聯(lián)合判斷,可推測患者主要是EBV既往感染。在數(shù)據(jù)不全的患者中可推測有3例HSIL和1例LSIL為現(xiàn)癥感染者。

3 討 論

3.1 EBV單獨感染的致病風險

3.2 EBV和HPV共感染的致病風險

Cameron等[4]的研究結(jié)果顯示,宮頸EBV和高危HPV合并感染的女性宮頸細胞學異常的風險比單純高危HPV檢測陽性的女性增加了約4倍。Joharinia等[5]報告HSIL中EBV感染的頻率高于LSIL,同時共感染患者的HPV載量升高,提示EBV可能是疾病進展的促進因素。在本研究Meta分析結(jié)果顯示,疾病分期越高,合并感染的ES值也越高,合并感染對LSIL、HSIL、SCC的致病風險分別是HPV單純感染的0.77、1.25、1.49倍。上述結(jié)果表明EBV與HPV共感染可促進宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。值得一提的是,對于LSIL患者而言,合并感染致病風險僅為HPV單純感染的0.77倍,這可能是由于合并感染后疾病快速向高級別轉(zhuǎn)化的結(jié)果。由于EBV單純感染與疾病進展相關(guān)性不大,與HPV合并感染后RR值隨疾病進展而升高的現(xiàn)象也可能是由于HPV感染后造成對EBV的易感性。

本研究中采用EBER檢測了宮頸組織中的EBV,出乎意料的是,包括異常增生細胞、腫瘤細胞在內(nèi)的所有樣本中均未發(fā)現(xiàn)EBER陽性。Al-Thawadi等[27]報告在大多數(shù)情況下,EBV的潛伏膜蛋白1(LMP1)與高危HPV的E6同源蛋白共同存在于HSIL癌細胞中,偶爾也存在于基質(zhì)以及腫瘤浸潤淋巴細胞中。但Aromseree等[7]、Shoji等[28]、O’Leary等[6]未在癌細胞中檢出EBER陽性,與本研究結(jié)果一致。在EBV致病機制上,一種觀點認為,EBV的LMP1和HPV16 E6蛋白結(jié)合,可增加致癌信號通路的傳導,抑制P53等抑癌通路[29-30],促進疾病進展[27,31]。還有一種觀點認為EBV可能通過感染B淋巴細胞而浸潤宮頸上皮組織,進一步產(chǎn)生部分作用導致疾病進展[32-33]。本研究結(jié)果更傾向支持后者,提示EBV可能不是通過直接攻擊本地患者宮頸上皮細胞致病的。

3.3 樣本類型對EBV檢出率的影響

本次Meta分析結(jié)果表明,樣本類型不同,EBV檢出率差異較大。采用宮頸拭子和細胞刷采集的樣本EBV陽性率分別為23.8%和36.9%,提示細胞刷法采集的樣本可能具有更高的EBV檢出率。其他研究也證明細胞刷取樣的敏感性較高,例如,金紅霞等[34]報告,對普查的3 567例育齡婦女進行傳統(tǒng)宮頸刮片取樣,同期隨機抽取1 068例行細胞刷法采樣,并對臨床診斷可疑者或細胞學診斷陽性者進行組織病理檢查或者陰道鏡檢查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞刷法真陽性率為92.96%,而刮片僅為33.33%。本研究結(jié)果提示,EBV篩查時采用細胞刷采樣可能比宮頸拭子更合適。

本次Meta分析結(jié)果表明EBV與HPV共感染會增加宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的風險,支持原假說。但臨床病例和Meta分析結(jié)果一致表明單純EBV感染與疾病進展的相關(guān)性不明顯甚至負相關(guān),究其原因,除了樣本量不夠大以外,也不排除EBV在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中作用確實較小的可能性。此外,臨床樣本EBER檢測結(jié)果提示EBV可能不是通過直接攻擊患者宮頸上皮細胞致病的。本研究結(jié)果還提示在EBV檢樣采集中,細胞刷法敏感性高于宮頸拭子。

本研究的優(yōu)點是:(1) 本研究首次報告了本地宮頸癌患者血液中EBV抗體概貌,指出本地患者EBV現(xiàn)癥感染率與宮頸癌進展無明顯相關(guān)性。(2) 首次報告本地患者病理組織中EBER全陰性,并由此推測EBV可能并非通過直接攻擊本地患者宮頸上皮細胞致病。

本研究也存在一些不足:(1) 本研究用于EBV的EBER檢測的樣本40例,用于EBV抗體檢測的樣本30例,樣本量不夠大。(2) 本研究中用于Meta分析的文獻量不夠大,涉及病例2 199例,有必要繼續(xù)收集文獻資料。