兩種方法檢測(cè)先天性心臟發(fā)育異常胎兒的染色體結(jié)果分析

趙丹陽，楊微微，王文靖，鞠明艷，任晨春

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300199）

先天性心臟發(fā)育異常（CHD）是最常見的人類先天性畸形之一[1]，是新生兒發(fā)病和死亡的主要原因。隨著超聲診斷技術(shù)和外科技術(shù)的提高，越來越多的胎兒期CHD 得到早期診斷和治療，如何盡早確定胎兒CHD 的病因，進(jìn)行個(gè)性化處理是產(chǎn)前診斷面臨的主要問題。雖然CHD 的病因存在異質(zhì)性，但仍有大約20%的CHD 可以歸因于染色體異常、單基因缺陷或環(huán)境因素[2]。本研究探討拷貝數(shù)變異測(cè)序（copy number variation sequencing，CNV-seq）技術(shù)聯(lián)合核型分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷胎兒期CHD 染色體異常的應(yīng)用價(jià)值，為臨床決策提供技術(shù)支持。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2019 年2 月至2022 年8 月在超聲科診斷為胎兒CHD 的單胎孕婦60 例，孕婦年齡18～45 歲，平均年齡（30.58±4.97）歲，孕周18～24 周，平均孕周為（21.70±2.25）周。所有孕婦均接受羊膜腔穿刺，對(duì)胎兒進(jìn)行核型分析，同時(shí)行CNV-seq檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）超聲科由一名具有副高及以上職稱的專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行超聲心動(dòng)檢查，檢測(cè)房室與大血管的關(guān)系，提示胎兒存在心臟及大血管結(jié)構(gòu)異常。（2）夫妻雙方均在醫(yī)院產(chǎn)前診斷門診進(jìn)行遺傳咨詢，了解有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的風(fēng)險(xiǎn)并簽署知情同意書。（3）術(shù)前進(jìn)行血常規(guī)、血生化、血凝及傳染病病原體篩查，無穿刺禁忌證。此項(xiàng)目經(jīng)院級(jí)專家倫理委員會(huì)審批通過，倫理編號(hào)為2020KY080。

1.2 研究方法

1.2.1 羊膜腔穿刺術(shù) 嚴(yán)格遵循無菌操作，在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，分別抽取2 管10 mL 羊水和1 管3 mL 羊水。

1.2.2 胎兒羊水細(xì)胞培養(yǎng)及核型分析 將獲得的2 管10 mL 羊水，1 500×g離心10 min 后分離羊水細(xì)胞，留取1 mL 沉淀混勻后分別接種于兩瓶含3 mL 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，7～9 d 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入0.3 mL 秋水仙素（20 μg/mL），培養(yǎng)2 h 后采用胰酶消化法收獲，進(jìn)行G 顯帶染色，必要時(shí)進(jìn)行C 顯帶或者N 顯帶，按照ISCN2020 版標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)30個(gè)，分析5 個(gè)分散好、中等長(zhǎng)度的中期分裂相。

1.2.3 胎兒羊水細(xì)胞CNV-seq 檢測(cè) 將抽取的1管3 mL 羊水，使用北京貝瑞和康公司提供的科安試劑盒，按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作：DNA 提取→酶反應(yīng)→純化→文庫(kù)純化→文庫(kù)質(zhì)控→測(cè)序→生物信息分析。結(jié)果判讀參照人類基因組hg19 版本和DGV、DECI-PHER、OMIM、UCSCS 及PubMed 等數(shù)據(jù)庫(kù)，判定為良性CNVs、可疑良性CNVs、臨床意義不明確的CNVs（VOUS）、可疑致病性CNVs 和致病性CNVs。對(duì)檢測(cè)到亞顯微結(jié)構(gòu)異常的致病性CNVs和可疑致病的CNVs，建議胎兒父母行CNV-seq 檢測(cè)，以明確變異的遺傳性質(zhì)及相關(guān)臨床意義。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)于臨床數(shù)據(jù)采用SPSS 25 軟件分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎兒超聲檢測(cè)結(jié)果 60 例CHD 胎兒中，23 例是獨(dú)立性CHD，其中10 例為室間隔缺損；37 例不僅有CHD，還伴有心外結(jié)構(gòu)/軟指標(biāo)異常，其中合并腦部異常10 例，泌尿系統(tǒng)異常3 例，消化系統(tǒng)異常2 例，其他畸形包括合并唇腭裂、長(zhǎng)骨短小、多指/趾或并指/趾共16 例，單臍動(dòng)脈6 例（表1）。

表1 60 例CHD 胎兒超聲結(jié)果分類表Tab.1 Ultrasound results of 60 fetuses with CHD

2.2 兩種方法檢測(cè)CHD 胎兒染色體結(jié)果分析 60例CHD 胎兒均行核型分析和CNV-seq 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)染色體異常20 例，染色體異常檢出率33.3%。其中核型分析與CNV-seq 結(jié)果一致檢出11 例，包括9 例數(shù)目異常和1 例衍生染色體及1 例嵌合體；兩種方法檢出不一致9 例，其中核型分析檢出2 例平衡性結(jié)構(gòu)異常，CNV-seq 未能檢出；7 例CNV-seq 檢出為微缺失/微重復(fù)綜合征，核型分析未見明顯異常（表2）。

表2 兩種方法檢測(cè)染色體異常CHD 胎兒結(jié)果分析Tab.2 Analysis of the results of chromosome abnormality of fetus with CHD by two methods

核型分析檢出染色體異常例數(shù)為13 例，其中數(shù)目異常9 例，包括4 例47，XX/XY，+21，3 例47，XX/XY，+18，1 例45，X，1 例47，XXY；結(jié)構(gòu)異常4例，包括羅氏易位45，XY，der（14；21）（q10；q10）1例，平衡易位46，XY，t（8；15）（p10；q10）1 例，衍生染色體1 例，核型為46，XY，der（18）dup（18）（q11.2-q23），嵌合體1 例，47，XY，+mar[16]/46，XY[19]。

CNV-seq 檢測(cè)異常CNVs 例數(shù)為18 例，其中數(shù)目異常9 例，同核型結(jié)果一致。存在微缺失/微重復(fù)異常9 例，1 例核型結(jié)果為衍生染色體的患者CNV-seq 檢測(cè)結(jié)果為dup（18）（q11.2q23）6.7 Mb；1例核型分析為47，XY，+mar[16]/46，XY[19]嵌合體，經(jīng)CNV-seq 證實(shí)為dup（22）（q11.1q11.21）1.7 Mb，確定了核型分析中marker 來源于22 號(hào)染色體；7例核型分析結(jié)果正常的患者CNV-seq 表現(xiàn)為微缺失/微重復(fù)，分別為dup（18）（q23）1Mb，dup（1）（p36.13）1.1 Mb，dup（22）（q11.21）2.55 Mb，4 例為del（22）（q11.21）2.65-2.7 Mb。所有CNVs 結(jié)果通過檢索UCSC、DECIPHER、OMIM、Clin Var、DGV、PUB -MED數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)致病性CNVs 6 例，可疑致病性CNVs 3 例（表3）。

表3 7 例CNV-seq 微缺失/微重復(fù)患者臨床表現(xiàn)Tab.3 Clinical manifestations of CNV-seq microdeletion/microduplication in 7 patients

2.3 不同類型CHD 胎兒的染色體異常結(jié)果分析伴心外結(jié)構(gòu)/軟指標(biāo)異常CHD 組染色體異常率高于獨(dú)立性CHD 組，但兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[37.8%（14/37）vs.26.1%（6/23），χ2=1.76，P>0.05]，見表4。

表4 兩組CHD 胎兒染色體異常檢出率比較Tab.4 Comparison of detection rates of fetal chromosomal abnormalities in CHD between the two groups

23 例獨(dú)立性CHD 中6 例有染色體異常：4 例表型為室間隔缺損，染色體結(jié)果分別為2 例21 三體，1 例羅氏易位，1 例平衡易位；1 例左心發(fā)育不良，染色體結(jié)果為1p36.13 存在1.1 Mb 重復(fù)；1 例三尖瓣狹窄、肺動(dòng)脈瓣閉鎖，染色體結(jié)果為18q23 存在1 Mb 重復(fù)。

37 例CHD 合并心外結(jié)構(gòu)/軟指標(biāo)異常中14 例有染色體異常：染色體數(shù)目異常占7 例，染色體結(jié)果分別為18 三體3 例，21 三體2 例，45，X 和47，XXY 各1 例，這7 例中5 例表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)異常（脈絡(luò)叢囊腫或腦積水），2 例為消化系統(tǒng)畸形。染色體結(jié)構(gòu)異常7 例，1 例核型46，XY，der（18）dup（18）（q11.2q23），胎兒表型為復(fù)雜性先心病，同時(shí)合并腎囊腫；1 例核型47，XY，+mar[16]/46，XY[19]，CNVseq 證實(shí)為dup（22）（q11.1q11.21）1.7 Mb，結(jié)合核型分析結(jié)果，考慮marker 為2 倍的22q11.1q11.21 結(jié)合后形成的新的染色體片段，表型為室間隔缺損伴消化系統(tǒng)畸形；其余5 例中4 例為22q11.2 微缺失綜合征，心臟畸形均為圓錐動(dòng)脈干異常，心外異常表現(xiàn)為脈絡(luò)叢囊腫/腦積水、唇腭裂、長(zhǎng)骨短小、單臍動(dòng)脈，1 例為22q11.2 微重復(fù)綜合征，重復(fù)片段大小為2.55 Mb，CHD 類型為三尖瓣狹窄，心外異常為脈絡(luò)叢囊腫。

3 討論

CHD 胎兒染色體異常率在10%～30%[3-4]。本研究中胎兒CHD 染色體異常率為33.3%（20/60）。染色體異常包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。其中21 三體、18 三體和13 三體是造成CHD 的染色體數(shù)目異常最常見病因，其他常見病因還包括染色體微缺失/微重復(fù)綜合征等[5-6]。

本研究CHD 胎兒檢出染色體異常共20 例，其中核型分析與CNV-seq 結(jié)果一致檢出11 例，包括9 例數(shù)目異常、1 例衍生染色體及1 例嵌合體；兩種方法檢出不一致9 例，其中核型分析獨(dú)立檢出2 例平衡性結(jié)構(gòu)異常，CNV-seq 獨(dú)立檢出7 例微缺失/微重復(fù)綜合征。兩種方法檢出率不一致與其方法局限性有關(guān)。在胎兒染色體檢測(cè)方面，核型分析是檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)染色體數(shù)目異常和大片段結(jié)構(gòu)缺失或重復(fù)有較高的診斷率，特別是可以檢出易位、倒位、插入等平衡性結(jié)構(gòu)異常，相對(duì)于分子診斷具有絕對(duì)性優(yōu)勢(shì)[7]。但是核型分析也存在很多短板，比如檢測(cè)周期長(zhǎng)，無法檢測(cè)5～10 Mb 以下微缺失/微重復(fù)，存在羊水培養(yǎng)失敗可能，受到從業(yè)人員經(jīng)驗(yàn)水平限制，存在一定的誤差。而CNV-seq 作為第二代低深度高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)樣本范圍廣，無需培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)小片段微缺失/微重復(fù)，2 周左右即可出具報(bào)告，節(jié)約時(shí)間成本。所以CNV-seq 技術(shù)是核型分析的有效補(bǔ)充，提高染色體異常的檢出率。

本研究60 例CHD 胎兒中，分為伴心外結(jié)構(gòu)/軟指標(biāo)異常CHD 組和獨(dú)立性CHD 組，染色體異常率在兩組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究選取樣本量過小相關(guān)。23 例獨(dú)立性CHD 中染色體異常6 例，2 例為21 三體，1 例為羅氏易位，1 例平衡易位，另外2 例微重復(fù)綜合征，通過CNV-seq 檢測(cè)得出。37 例CHD 合并心外結(jié)構(gòu)/軟指標(biāo)中14 例有染色體異常，核型檢出率為64.3%（9/14），明顯低于CNV-seq 檢出的檢出率100%（14/14）。其中值得注意的是，1 例核型結(jié)果為18 號(hào)染色體的衍生染色體，核型為46，XY，der（18），通過CNV-seq 檢測(cè)確定是18 號(hào)染色體的重復(fù)，重復(fù)片段為q11.2q23。1 例核型分析存在低比例嵌合，并發(fā)現(xiàn)標(biāo)記染色體，核型47，XY，+mar[16]/46，XY[19]，CNV-seq 結(jié)果為22q11.1q11.21 長(zhǎng)度為1.7 Mb 的微重復(fù)，通過核型嵌合比例結(jié)合CNV-seq 結(jié)果，可推測(cè)該患兒marker染色體為2 倍的22q11.1q11.21 片段重合組成，該片段包含TUBA8、PEX26、USP18 等16 個(gè)蛋白編碼基因或基因片段，其中6 個(gè)OMIM morbid 基因，該重復(fù)片段與貓眼綜合征有關(guān)，該綜合征臨床表型多種多樣，如雙眼虹膜下方垂直性缺損、白內(nèi)障、脈絡(luò)膜缺損、視網(wǎng)膜發(fā)育不全、類似貓眼、雙眼距離增寬、瞼裂小而斜、小眼球、斜視、輕度智力低下、心臟缺陷、肛門閉鎖等，確定為致病性CNVs。雖然核型分析較CNV-seq 在大片段結(jié)構(gòu)變異中更為直觀，但CNV-seq 較核型分析斷裂位點(diǎn)定位更為精確，兩者在胎兒CHD 患者病因診斷中相互結(jié)合，能夠有效提高CHD 的確診率，明確染色體異常類型和斷裂位點(diǎn)，為臨床做出進(jìn)一步診療提供依據(jù)。

本研究有4 例CHD 胎兒存在22q11.2 微缺失，22q11.2 微缺失綜合征被認(rèn)為是與CHD 最相關(guān)的微缺失/微重復(fù)綜合征。它的表型變異譜比較寬，攜帶相同異常片段的個(gè)體表型不盡相同，可以從正常到生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、智力障礙、自閉癥、先天性心臟病、唇腭裂、小頭畸形、肌張力減弱等，片段缺失大小與表型之間不存在正相關(guān)，其外顯率約21.9%[8-11]。Thomas 等[12]報(bào)道，22q11.2 微缺失綜合征在胎兒CHD核型結(jié)果正常者中占6.4%。王瑾等[13]報(bào)道64%的22q11.2 微缺失綜合征患者有CHD 表型，以圓錐動(dòng)脈干畸形最為多見。這4 例CHD 胎兒心臟表型主要為永存動(dòng)脈干、房室間隔缺損、肺動(dòng)脈瓣狹窄、法洛氏四聯(lián)癥，心外表現(xiàn)為唇腭裂、單臍動(dòng)脈、脈絡(luò)叢囊腫和胎兒發(fā)育遲緩。它們父母表型正常，經(jīng)CNV-seq 檢測(cè)均為正常，證實(shí)胎兒為新發(fā)突變。除微缺失綜合征以外，本研究經(jīng)CNV-seq 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1例22q11.2 微重復(fù)綜合征，表型為三尖瓣狹窄，伴有心外異常（脈絡(luò)叢囊腫）。由此可見22q11.2 微缺失/微重復(fù)是胎兒CHD 的另一主要病因。

綜上所述，兩種方法在檢測(cè)CHD 胎兒染色體異常中各有利弊，聯(lián)合應(yīng)用可提高染色體異常檢出率，從而明確胎兒CHD 的病因，為后續(xù)的遺傳咨詢提供可靠的病因?qū)W依據(jù)，指導(dǎo)患兒家庭做出最優(yōu)選擇。