單籠飼養(yǎng)聯(lián)合卵清蛋白制備幼齡SD大鼠支氣管哮喘伴抑郁模型*

李成堯 楊景龍 王雪旦 史瑞明

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院小兒內(nèi)科,西安 710004)(2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科,西安 710061)

支氣管哮喘(bronchial asthma,BA)是兒童最常見的慢性呼吸道疾病之一。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),我國城市兒童支氣管哮喘發(fā)病率逐年上升[1]。支氣管哮喘尚無有效的根治手段,主要是基于癥狀控制的管理模式,即遵循早開始、長(zhǎng)期、規(guī)范、個(gè)體化原則,以控制急性發(fā)作、降低危險(xiǎn)度分級(jí)及改善預(yù)后為主要治療目標(biāo)。

隨著全球哮喘防治創(chuàng)議(Global Initiative for Asthma,GINA)在國內(nèi)的推廣及國家對(duì)公共衛(wèi)生防治工作的投入,我國哮喘患者的總體控制水平較前已有明顯提高[2],但仍低于發(fā)達(dá)國家。兒童支氣管哮喘由于診斷困難、治療依從性低及身處特殊生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期等原因,目前我國兒童哮喘患者的總體控制水平尚不理想[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者的呼吸道癥狀,如咳嗽、喘息、胸悶和呼吸困難等與精神心理狀態(tài)密切相關(guān),精神心理壓力等因素可顯著增加哮喘患者罹患抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn),而抑郁等精神心理障礙又常導(dǎo)致反復(fù)的哮喘發(fā)作、ACT評(píng)分降低等,形成惡性循環(huán),嚴(yán)重影響哮喘總體控制水平[4]。

兒童作為特殊群體,因其抑郁篩查、診斷及治療的局限性,同時(shí)相關(guān)的臨床實(shí)驗(yàn)存在倫理風(fēng)險(xiǎn),故國內(nèi)外關(guān)于兒童支氣管哮喘合并抑郁障礙的相關(guān)研究報(bào)道較少。為研究?jī)煞N疾病之間的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系等,本課題組選用幼齡SD大鼠制備支氣管哮喘伴抑郁樣行為動(dòng)物模型,旨在為兩者之間的探索和研究提供了一個(gè)客觀、可靠、有效的手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:3周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量(60±10)g,購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(陜)2023-002】,飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)基礎(chǔ)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)【SYXK(陜)2023-004】,所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后隨機(jī)分為群養(yǎng)對(duì)照組、孤養(yǎng)對(duì)照組、群養(yǎng)哮喘組、孤養(yǎng)哮喘組,每組8只,實(shí)驗(yàn)室環(huán)境:室溫(23±2)℃,濕度恒定,持續(xù)通風(fēng),環(huán)境安靜,采用12 h/12 h晝夜間斷照明(7∶00—19∶00),標(biāo)準(zhǔn)飼料,消毒條件等同。每日早晚各觀察大鼠1次(各項(xiàng)體征),每周稱重大鼠1次并記錄,群養(yǎng)對(duì)照組8只鼠群飼養(yǎng)于1籠(930 mm×620 mm×250 mm),孤養(yǎng)組均為單飼養(yǎng)(320 mm×180 mm×150 mm),各籠間隔10 cm,大小鼠籠間隔擺放,鼠籠以1次/周頻次進(jìn)行換籠,木屑?jí)|料以2 天/次頻次更換。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品及儀器:卵清蛋白(ovalbumin,OVA)及氫氧化鋁(Sigma公司),IL-4、BDNF Elisa試劑盒(上海酶聯(lián)生物),余試劑(均西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑中心),超聲霧化泵(江蘇魚躍)。

1.2 方法

1.2.1模型制備:大鼠從3周齡開始進(jìn)行為期4 d的適應(yīng)性飼養(yǎng),將初次糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)束記實(shí)驗(yàn)開始,在實(shí)驗(yàn)開始后第1,7,14天分別向群養(yǎng)對(duì)照組、孤養(yǎng)對(duì)照組的每只大鼠腹腔內(nèi)注射1 mL 1×PBS緩沖液,群養(yǎng)哮喘組、孤養(yǎng)哮喘組的每只大鼠腹腔內(nèi)注射1 mL OVA致敏液(每1 mL溶液含OVA 0.1 mg,氫氧化鋁 50 mg),第15至21天分別對(duì)群養(yǎng)對(duì)照組、孤養(yǎng)對(duì)照組予80 mL 0.9%氯化鈉溶液霧化熏蒸30 min,群養(yǎng)哮喘組、孤養(yǎng)哮喘組的大鼠給予80 mL OVA激發(fā)液(每1 mL溶液內(nèi)含1 mg卵清蛋白)霧化熏蒸30 min,實(shí)驗(yàn)第22、23、24天行末次糖水偏好實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)第25、26天行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)第27天早上8∶00分別給予80 mL 0.9%氯化鈉溶液及80 mL OVA激發(fā)液霧化熏蒸30 min后安樂死,實(shí)驗(yàn)全程共27 d,實(shí)驗(yàn)安樂死時(shí)所有大鼠的鼠齡均為55日齡。

1.2.2糖水偏好實(shí)驗(yàn):各組動(dòng)物均于模型制備前后進(jìn)行該實(shí)驗(yàn),在第1天內(nèi),對(duì)所有大鼠均1鼠1籠飼養(yǎng)行適應(yīng)性訓(xùn)練,每籠均置入兩瓶濃度為1%的蔗糖水溶液,第2天分為兩部分,前12 h將其中的一瓶蔗糖水溶液換成純水,之后的12 h將蔗糖水溶液瓶及純水瓶的位置進(jìn)行交換,適應(yīng)結(jié)束后,禁食禁水24 h,之后12 h同時(shí)給予大鼠事前稱量好的糖水及純水(為避免水瓶位置干擾,各組標(biāo)記為單號(hào)大鼠的鼠籠中左側(cè)為糖水,右側(cè)為純水,各組標(biāo)記為雙號(hào)大鼠的鼠籠中左側(cè)為純水,右側(cè)為糖水),測(cè)試過程全程禁食,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別對(duì)各籠中蔗糖水溶液瓶及純水瓶進(jìn)行稱重,記錄各液體消耗,并計(jì)算糖水偏好指數(shù)。SPI=糖水消耗量(g)/【糖水消耗量(g)+純水消耗量(g)】×100%。

1.2.3強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn):各組動(dòng)物于末次糖水消耗實(shí)驗(yàn)后的第2天進(jìn)行實(shí)驗(yàn),第1個(gè)24 h對(duì)大鼠行適應(yīng)性訓(xùn)練,置于40 cm(水深:20 cm,水溫:24±1 ℃)透明塑料水桶中,行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練15 min,結(jié)束后室溫烘干、歸籠,第2天在同等條件下進(jìn)行強(qiáng)迫游泳6 min,雙盲記錄每只大鼠在后5 min內(nèi)出現(xiàn)“行為絕望”表現(xiàn)的時(shí)間(以雙后肢是否出現(xiàn)活動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)),取均值。

1.2.4血細(xì)胞分類及計(jì)數(shù):末次霧化激發(fā)后,腹主動(dòng)脈取血5 mL注入預(yù)先標(biāo)記的 EDTA管中,常溫下送至西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科行血常規(guī)五分類分析。

1.2.5血清中IL-4及BDNF測(cè)定:末次霧化激發(fā)后,腹主動(dòng)脈取血5 mL注入預(yù)先標(biāo)記的促凝管中,低溫高速離心機(jī)2500 r/min離心20 min后取上層血清,ELISA法測(cè)定血清中IL-4及BDNF水平。

1.2.6肺組織HE染色:大鼠處死后,取右肺組織于4%多聚甲醛進(jìn)行固定,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色后于光鏡下觀察肺組織變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體征變化情況

在致敏階段各組大鼠精神狀態(tài)佳,體型肥碩,呼吸正常,毛色鮮亮,僅孤養(yǎng)對(duì)照組及孤養(yǎng)哮喘組表現(xiàn)輕度活動(dòng)量減少;在激發(fā)階段,兩對(duì)照組僅在激發(fā)初始階段表現(xiàn)輕度煩躁不安,不停走動(dòng),余未出現(xiàn)異常行為。群養(yǎng)哮喘組則表現(xiàn)明顯煩躁不安,出現(xiàn)互相撕咬、抓耳撓鼻、呼吸急促、點(diǎn)頭呼吸等表現(xiàn),歸籠后出現(xiàn)膽小易驚等表現(xiàn)。孤養(yǎng)哮喘組則出現(xiàn)活動(dòng)減少,呼吸節(jié)律不齊,口周輕度發(fā)紺,歸籠后出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、進(jìn)食水減少等表現(xiàn)。激發(fā)結(jié)束后群養(yǎng)哮喘組及孤養(yǎng)哮喘組均出現(xiàn)毛色暗淡、活動(dòng)減少等表現(xiàn)。

2.2 體質(zhì)量變化情況

適應(yīng)性飼養(yǎng)后各組大鼠體質(zhì)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在哮喘大鼠模型的致敏過程(0～2周)中,各組體質(zhì)量折線基本擬合,在激發(fā)過程(3周)中,兩對(duì)照組體質(zhì)量曲線未見明顯差異(P>0.05),而群養(yǎng)哮喘組和孤養(yǎng)哮喘組體質(zhì)量曲線均顯著低于兩對(duì)照組(P<0.05),孤養(yǎng)哮喘組體質(zhì)量曲線顯著低于群養(yǎng)哮喘組(P<0.05),見圖1。

注:與兩對(duì)照組比較,aP<0.05;與群養(yǎng)哮喘組比較,bP<0.05。Note:Comparison with the two control groups, aP <0.05;Comparison with the group asthma group, bP <0.05.

2.3 血細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)

群養(yǎng)哮喘組及孤養(yǎng)哮喘組靜脈血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于兩對(duì)照組(P<0.05),分類中主要以淋巴細(xì)胞為主,淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于兩對(duì)照組(P<0.05),其中孤養(yǎng)哮喘組嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于兩對(duì)照組,群養(yǎng)哮喘組嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于孤養(yǎng)哮喘組及兩對(duì)照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠血細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)Table 1 Classification and counting of

2.4 血清中IL-4及BDNF水平

群養(yǎng)哮喘組及孤養(yǎng)哮喘組血清中IL-4水平明顯高于兩對(duì)照組(P<0.05),孤養(yǎng)哮喘組血清中IL-4水平較群養(yǎng)哮喘組稍增高(P<0.05);兩對(duì)照組血清中BDNF水平未見明顯差異,群養(yǎng)哮喘組血清中BDNF水平低于兩對(duì)照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),孤養(yǎng)哮喘組血清中BDNF水平明顯低于兩對(duì)照組(P<0.05),孤養(yǎng)哮喘組血清中BDNF水平低于群養(yǎng)哮喘組(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-4及BDNF水平Table 2 Levels of IL-4 and BDNF in

2.5 肺組織病理

群養(yǎng)對(duì)照組及孤養(yǎng)對(duì)照組大鼠支氣管管壁形態(tài)規(guī)則,管腔光滑無閉塞,肺泡壁清晰完整,間隔形態(tài)正常,周圍未見炎性細(xì)胞浸潤;群養(yǎng)哮喘組及孤養(yǎng)哮喘組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯炎癥,支氣管管壁及周圍組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤,肺泡壁炎性細(xì)胞浸潤、肺泡內(nèi)見滲出物,部分肺泡呈擴(kuò)張狀態(tài)(圖2)。

圖2 大鼠肺組織HE染色(×200)Fig.2 HE staining of rats lung tissue(×200)

2.6 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

各組大鼠在初次糖水偏好實(shí)驗(yàn)中測(cè)得糖水偏好指數(shù)【糖水偏好指數(shù)(%)=糖水消耗量(g)/(糖水消耗量(g)+純水消耗量(g)×100%】未見差異;末次糖水消耗實(shí)驗(yàn)中,孤養(yǎng)哮喘組較群養(yǎng)哮喘組及兩對(duì)照組糖水偏好指數(shù)明顯降低(P<0.05),在各組大鼠初末兩次糖水消耗實(shí)驗(yàn)所測(cè)得糖水偏好指數(shù)對(duì)比中,兩對(duì)照組及群養(yǎng)哮喘組的末次糖水偏好指數(shù)均較初次糖水偏好指數(shù)明顯提高(P<0.05),孤養(yǎng)哮喘組的末次糖水偏好指數(shù)較初次糖水偏好指數(shù)降低(P<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠糖水偏好指數(shù)Table 3 Sugar water preference index of

2.7 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

在6 min強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中,群養(yǎng)哮喘組(32.64±9.09)較兩對(duì)照組(31.77±8.36)(30.63±9.24)靜止不動(dòng)時(shí)間稍長(zhǎng),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。孤養(yǎng)哮喘組(64.42±16.04)較群養(yǎng)哮喘組及兩對(duì)照組靜止不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)(P<0.05)。

3 討論

支氣管哮喘動(dòng)物模型的制備常選用嚙齒類動(dòng)物,制備方法多為生物制品進(jìn)行致敏激發(fā),有研究應(yīng)用OVA加氫氧化鋁腹腔注射聯(lián)合OVA溶液激發(fā)制備支氣管哮喘大鼠模型[5];有研究采用RSV成功誘導(dǎo)出感染性哮喘小鼠模型[6];有研究采用屋塵螨滴劑成功制備支氣管哮喘小鼠模型[7]。抑郁動(dòng)物模型的建立因研究方向的不同其抑郁模型制備的方法也各有不同,有研究采用輕度不可逃避電刺激誘導(dǎo)大鼠獲得性無助模型[8];采用不可預(yù)知的溫和刺激來刺激大鼠產(chǎn)生抑郁[9];選用基因編輯技術(shù)構(gòu)建Tph1/Tph2轉(zhuǎn)基因鼠,通過降低大鼠體內(nèi)色氨酸羥化酶的數(shù)量及活性來降低大鼠腦內(nèi)5-HT水平,使其產(chǎn)生抑郁表現(xiàn)[10]。

傳統(tǒng)復(fù)合動(dòng)物模型的制備方法多為誘導(dǎo)動(dòng)物單一疾病發(fā)病,在其基礎(chǔ)上誘導(dǎo)產(chǎn)生另一種疾病,如有研究選用OVA對(duì)大鼠致敏激發(fā)后再通過輕度不可預(yù)見性應(yīng)激來構(gòu)建哮喘伴抑郁大鼠模型[11],盡管通過該方法制備的動(dòng)物模型具有顯著的抑郁特征,但應(yīng)用于兒童哮喘伴抑郁的研究中仍存在諸多局限。與成年哮喘患者相比,兒童哮喘患者少有復(fù)合應(yīng)激刺激的持續(xù)存在,更多的是由于哮喘發(fā)生、發(fā)展的過程出現(xiàn)的情緒低落,亦或是反復(fù)發(fā)作所導(dǎo)致的自卑、孤獨(dú)及自信缺乏等輕度抑郁癥狀。相關(guān)研究調(diào)查發(fā)現(xiàn),孤獨(dú)感作為抑郁的先行因素,可穩(wěn)定預(yù)測(cè)抑郁的發(fā)生[12],兒童時(shí)期隨著同伴交往的重要性日益凸顯,孤獨(dú)感也隨年齡顯著提升,盡管一定的孤獨(dú)體驗(yàn)有利于兒童健全人格的發(fā)展[13],但是長(zhǎng)期的孤獨(dú)體驗(yàn)勢(shì)必會(huì)引起嚴(yán)重的自我否定,導(dǎo)致抑郁等情緒障礙。

為了盡可能確保動(dòng)物模型符合兒童生長(zhǎng)的特殊時(shí)期以及哮喘伴抑郁在發(fā)生、發(fā)展的時(shí)空一致性上,本研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用了3周齡雄性SD大鼠,在實(shí)驗(yàn)過程中同時(shí)誘發(fā)哮喘和抑郁發(fā)病,且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)所有大鼠均未達(dá)性成熟及社會(huì)性成熟的鼠齡低限[14-15],確保了模型能更好的反映兒童哮喘伴抑郁群體的病理、生理及免疫等特點(diǎn)。在哮喘模型制備方面,本研究主要參考Marta等所用的方法同時(shí)加以改進(jìn)制備幼齡大鼠哮喘模型[16]。同時(shí)通過將屬群居動(dòng)物的SD大鼠通過單籠飼養(yǎng)來誘發(fā)其抑郁樣行為,旨在模擬哮喘兒童在發(fā)病過程中常因請(qǐng)假就醫(yī)導(dǎo)致缺席集體活動(dòng),或因懼怕哮喘急性發(fā)作而產(chǎn)生社交回避等行為。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在激發(fā)階段與兩對(duì)照組相比,所有經(jīng)過OVA生理鹽水霧化激發(fā)的大鼠均出現(xiàn)了典型的哮喘癥狀,同時(shí)肺組織也出現(xiàn)了哮喘樣氣道損傷,全血細(xì)胞中白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均增高,血清中IL-4含量升高等均符合典型支氣管哮喘表現(xiàn)。抑郁模型的評(píng)價(jià)則選用大鼠癥狀、體質(zhì)量、BDNF及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。糖水偏好實(shí)驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)蔗糖水甜味的偏好來評(píng)價(jià)是否出現(xiàn)“快感缺失”,強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)則是評(píng)價(jià)動(dòng)物“行為絕望”的經(jīng)典方法。在本次實(shí)驗(yàn)過程中,各組大鼠的初末次糖水?dāng)z取指數(shù)對(duì)比均明顯升高,表明隨著鼠齡的增長(zhǎng),大鼠對(duì)甜味的喜好逐漸增加,這一現(xiàn)象也基本符合在嬰幼兒成長(zhǎng)過程中隨年齡增加對(duì)愉悅事物的興趣度增加。

末次糖水偏好實(shí)驗(yàn)中僅孤籠哮喘組的大鼠出現(xiàn)糖水偏好指數(shù)降低,且強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中靜止不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)等均表明僅單籠飼養(yǎng)和僅OVA致敏激發(fā)不會(huì)導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。在兩對(duì)照組中,只改變鼠籠飼養(yǎng)條件,單籠飼養(yǎng)的大鼠僅出現(xiàn)輕度活動(dòng)減少,而糖水偏好指數(shù)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中靜止不動(dòng)時(shí)間結(jié)果均無差異,說明鼠籠的選擇作為單因素變量時(shí)并不會(huì)使大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。從以上現(xiàn)象中不難推測(cè)對(duì)于兒童哮喘患者來說,或許孤獨(dú)感的長(zhǎng)期持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致患兒出現(xiàn)抑郁表現(xiàn),但在軀體健康的情況下,短期的孤獨(dú)感并不會(huì)影響其心理健康。而在兩種負(fù)面因素的同時(shí)干預(yù)下,孤養(yǎng)哮喘組出現(xiàn)典型哮喘及抑郁樣行為,也說明通過OVA來制備哮喘模型的過程中,同時(shí)施加孤獨(dú)這一負(fù)面因素可使該動(dòng)物模型達(dá)到預(yù)期要求。

本研究在鼠齡選擇、制備方法等方面對(duì)以往哮喘伴抑郁共病模型的制備方法進(jìn)行了改良,使其盡可能的模擬和還原兒童哮喘患者在哮喘的發(fā)生和發(fā)展過程中所出現(xiàn)的情形,同時(shí)制備方法可靠,且各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果便于觀察和分析,故能更好的適用于兒童支氣管哮喘伴抑郁的相關(guān)問題研究,期望該模型能為以后進(jìn)一步開展兒童哮喘伴抑郁的研究提供借鑒與幫助。