腐殖酸鈉對白羽肉雞營養物質表觀消化率、糞便微生物及其代謝產物的影響

李貞明,余 苗,2,唐延天,李袁飛,劉志昌,容 庭,3*,馬現永,2*

(1.廣東省農業科學院動物科學研究所 豬禽種業全國重點實驗室 農業部華南動物營養與飼料重點實驗室 廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室 廣東省畜禽肉品質量安全控制與評定工程技術研究中心,廣州 510640;2.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心,茂名 525000;3.清遠市弘順農牧有限公司,清遠 511500)

據《第二次全國污染源普查公報》[1]顯示,全國畜禽養殖業水污染排放量中,化學需氧量達到了1 000.53萬噸,氨氮11.09萬噸,總氮59.63萬噸,總磷11.97萬噸。針對畜禽污染,我國出臺了多項政策并提出了源頭減排、過程控制和末端利用的全方位減排理念,其中源頭減排主要是通過合理選擇飼料原料和在飼料中添加益生菌、天然提取物和酶制劑等的途徑來實現[2]。相較于過程控制和末端利用,源頭減排成本低,并具有事半功倍的效果,對畜禽養殖污染物的減排具有重要意義[3-4]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

腐殖酸鈉中水溶性腐殖酸含量(干物質基礎)≥70%。由輝昂化工有限公司提供。

1.2 試驗設計

試驗選取540只1日齡817白羽肉雞,隨機分為3組(每組6個重復,每個重復30只)。對照組飼喂不含抗生素的基礎日糧,試驗組分別飼喂含0.3%和0.5%腐殖酸鈉的試驗飼糧。試驗為期42 d?；A日糧選取玉米、豆粕等原料,參照NRC(1994)并結合中華人民共和國農業行業標準《雞飼養標準》(NY/T33—2004)進行配制,并制成顆粒料?；A日糧組成和營養水平見表1。試驗結束前3 d,每個重復選取體重相近的2只肉雞放入代謝籠,采取全收糞法進行消化代謝試驗。

表1 基礎日糧組成及營養水平(飼喂基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (as-fed basis) %

1.3 飼養管理

試驗雞飼養于廣東省農業科學院動物科學研究所試驗場,采用地面平養。全期試驗雞自由采食和飲水;1～28日齡,欄舍封閉,室溫保持32 ℃,采用全天光照;29～42日齡,欄舍開放,采用自然光照。其他按照常規飼養程序和免疫程序進行飼養和免疫。

1.4 樣品采集

試驗結束前3 d,每個重復選取體重相近的2只肉雞放入代謝籠,采取全收糞法進行消化代謝試驗。每天10:00收集糞樣,并剔除羽毛,隨后置于自封袋中,于-20 ℃冰箱保存。連續收集3 d后,取300 g糞樣,加入20 mL 10%硫酸,混合均勻。將日糧和糞樣65 ℃烘干至恒重,室溫回潮24 h后,稱重并粉碎。用于測定其中干物質(DM)、能量(GE)、粗蛋白質(CP)、粗脂肪(EE)、鈣(Ca)、磷(P)和粗灰分(Ash)的含量,計算營養物質的表觀消化率。另取10 g新鮮糞樣保存于-80 ℃冰箱,用于后續微生物及其代謝產物的檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 營養物質表觀消化率的檢測 日糧和糞樣中營養物質的表觀消化率的檢測方法如下:分別按照GB/T6435—2006、GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018和GB/T 6438—2007測定DM、CP、EE、Ca、P和Ash,采用全自動氧彈熱量計Parr 6400(Parr,美國)測定GE。

營養物質表觀消化率(%)= 100×[(日糧中營養物質的量-對應糞中該營養物質的量)/日糧中營養物質的量]。

1.5.2 糞便微生物DNA提取和熒光定量PCR檢測 稱取0.20 g糞樣,利用糞便DNA純化試劑盒(4101050,杭州新景生物試劑開發有限公司)提取、純化糞便中微生物的總DNA,采用核酸蛋白測定儀(Nanodrop 1000,Thermo Fisher Scientific)測定DNA的濃度和質量,樣品標準吸光度為260/280 在1.80～2.00,260/230 在2.00 左右。采用熒光定量PCR儀(CFX96 Real-time PCR System,Bio-Rad)對糞樣中總菌(total bacteria)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、普雷沃氏菌(Prevotella)、梭菌IV(ClostridiumclusterIV)、瘤胃球菌(Ruminococcus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的16S rRNA基因拷貝數進行定量分析,并以10倍梯度稀釋的標準質粒作為模板建立標準曲線,標準質粒由廣東省農業科學院豬禽種業全國重點實驗室提供,計算結果均表示為每克糞樣中16S rRNA基因的拷貝數。PCR的反應體系和擴增程序具體參照Yu等[10]的方法,特異性引物由上海生工基因技術有限公司廣州分公司合成,PCR引物如表2[11-18]所示。

表2 定量微生物種類以及引物Table 2 Quantitative microbial species and primers

1.5.3 糞便中微生物代謝產物的檢測 氨態氮含量的檢測:根據Chaney和Marbach[19]的方法,采用比色法測定糞樣中氨態氮的含量。

乳酸含量的測定:按照試劑盒說明書步驟測定糞樣中乳酸的含量,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

酚和吲哚類物質的檢測:參照Yu等[10]的方法處理樣品。使用高效液相色譜儀(Waters Alliance e2695,Waters)測定糞樣中酚和吲哚類化合物質,并利用外標法通過標準曲線計算其含量。

生物胺含量測定:參照Yu等[10]的方法處理樣品。使用高效液相色譜儀(Waters Alliance e2695,Waters)測定糞樣中生物胺,并利用外標法通過標準曲線計算其含量。

1.6 數據統計與分析

營養物質表觀消化率、微生物和微生物代謝產物的數據結果均以籠為統計單位,采用SPSS 20.0統計軟件中單因子方差分析(one-way ANOVA,LSD)方法進行統計分析,使用Duncan氏多重比較檢驗。所有數據均表示為“平均值±標準誤”,P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 腐殖酸鈉對肉雞表觀消化率的影響

由表3可知,與對照組相比,日糧添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著提高肉雞對粗蛋白質、磷和灰分的表觀消化率(P<0.05)。不同日糧處理對日糧中干物質、總能、粗脂肪和鈣的表觀消化率無顯著影響(P>0.05)。

表3 腐殖酸鈉對肉雞日糧養分表觀消化率的影響Table 3 Effect of sodium humate on dietary nutrients apparent digestibility of broilers %

2.2 腐殖酸鈉對肉雞糞便中微生物數量的影響

由表4可知,與對照組和0.3%組相比,日糧中添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著提高肉雞糞便中總菌和乳酸桿菌的數量,并降低大腸桿菌的數量(P<0.05)。與0.3%組相比,日糧中添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著提高肉雞糞便中普雷沃氏菌的數量(P<0.05)。不同日糧處理對肉雞糞便中厚壁菌門、擬桿菌門、雙歧桿菌、梭菌IV和瘤胃球菌無顯著影響(P>0.05)。

表4 腐殖酸鈉對白羽肉雞糞便中微生物數量的影響Table 4 Effect of sodium humate on the number of microorganisms in the feces of white-feathered broilers lg(16S基因拷貝數)·g-1

2.3 腐殖酸鈉對肉雞糞便中氨態氮、乳酸、酚和吲哚類化合物含量的影響

由表5可知,與對照組相比,日糧中添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著降低肉雞糞便中氨態氮的含量,并提高乳酸的含量(P<0.05)。與對照組和0.3%組相比,0.5%組肉雞糞便中的對甲酚顯著降低(P<0.05)。不同日糧處理對肉雞糞便中苯酚、吲哚和糞臭素無顯著影響(P>0.05)。

表5 腐殖酸鈉對肉雞糞便中乳酸和含氮化合物含量的影響Table 5 Effect of sodium humate on lactic acid and nitrogenous compounds concentrations in broilers′ manure

2.4 腐殖酸鈉對肉雞糞便中生物胺含量的影響

由表6可知,與對照組和0.3%組相比,日糧添加0.5%腐殖酸鈉可顯著降低肉雞糞便中酪胺、亞精胺、精胺和總生物胺的含量(P<0.05)。與對照組相比,日糧添加0.3%和0.5%腐殖酸鈉可顯著降低肉雞糞便中腐胺的含量(P<0.05);另外,日糧添加0.3%腐殖酸鈉可顯著降低肉雞糞便中酪胺和精胺的含量(P<0.05)。不同日糧處理對肉雞糞便中甲胺、色胺和尸胺的含量無顯著影響(P>0.05)。

表6 腐殖酸鈉對肉雞糞便中生物胺含量的影響Table 6 Effect of sodium humate on biogenic amine concentrations in broilers′ manure μg·g-1

3 討 論

3.1 腐殖酸鈉對肉雞營養物質表觀消化率的影響

表觀消化率是反映試驗動物對日糧中營養物質消化吸收水平的重要指標。在本試驗中,日糧添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著提高粗蛋白、磷和灰分的表觀消化率。Wang等[20]研究發現,日糧添加腐殖酸鈉可顯著提高肉雞對有機物和干物質的表觀消化率。Wang等[21]研究則表明,羔羊對日糧養分的表觀消化率不受腐殖酸的影響。本試驗結果與上述的結果并不一致,可能是添加劑量和生產廠家的不同所導致的,具體原因還需進一步研究。腐殖酸鈉是一種有機弱酸鹽,可調節并穩定畜禽消化系統中的pH,提高消化酶的活性,促進畜禽腸道對營養物質的消化與吸收[22-24]。同時,腐殖酸鈉作為一種螯合劑,具有較強的絡合力、離子交換作用和吸附作用,在日糧經過畜禽腸道時,腐殖酸鈉通過吸附作用使日糧中的營養物質緩慢通過腸道,延長營養物質的消化吸收時間,提高營養物質的表觀消化率[25-26]。因此,腐殖酸鈉提高肉雞對營養物質的表觀消化率,可能是因為腐殖酸鈉提高了肉雞腸道中有益菌的數量,穩定了腸道環境的pH,刺激消化酶分泌,并通過吸附作用,延長營養物質的消化吸收時間,進而提高肉雞對營養物質的表觀消化率。

3.2 腐殖酸鈉對肉雞糞便中微生物數量的影響

腸道菌群與畜禽機體代謝和健康水平密切相關,是維持腸道屏障功能和穩定腸道微生態環境的關鍵[27]。乳酸桿菌和普雷沃氏菌是肉雞腸道中的有益菌,乳酸桿菌作為優勢菌群定植在肉雞腸道中,具有產生揮發性脂肪酸和抑菌因子的功效,可有效改善腸道環境,抑制有害菌的生長和繁殖;普雷沃氏菌是短鏈脂肪酸的主要生產菌,可通過促進腸道黏膜的發育來穩定腸道環境[28-29]。大腸桿菌屬于畜禽腸道中常見的病原菌,產生內毒素和腸毒素破壞腸道黏膜屏障,導致畜禽腸道感染,影響畜禽機體健康[30]。在本試驗中,日糧添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著提高肉雞糞便中乳酸桿菌的數量,并降低大腸桿菌的數量。這與Domínguez-Negrete等[31]研究一致。腐殖酸鈉是一種多功能化合物,富含生物堿、維生素和生物活性物質,具有抗菌、抗炎和止瀉等功能[32]。腐殖酸鈉能夠調控腸道菌群,可能是因為腐殖酸鈉富含多種功能性活性物質,促進有益菌的生長繁殖,使有益菌分泌乳酸、短鏈脂肪酸和抑菌因子等,抑制大腸桿菌等有害菌的生長繁殖。這也進一步驗證了腐殖酸鈉可通過改善腸道微生態環境,提高肉雞對營養物質的表觀消化率。

3.3 腐殖酸鈉對肉雞糞便中乳酸和含氮化合物含量的影響

日糧中未被胃和小腸消化吸收的含氮物質進入后腸后會被微生物發酵生成氨態氮、酚和吲哚類化合物等臭味物質,其中高濃度氨態氮抑制腸道上皮細胞的增殖與分化,降低線粒體的氧化作用,增加腹瀉率;高濃度對甲酚具有遺傳毒性和致癌性,不利于腸道健康[33-34]。McMurphy等[35]和Ikyume等[36]研究表明,腐殖酸具有較強的氮結合能力,可顯著降低肉牛和山羊瘤胃中氨態氮的濃度。本試驗中,肉雞糞便中氨態氮和對甲酚的濃度顯著降低,可能與腐殖酸鈉的氮結合能力有關。此外,日糧添加0.5%的腐殖酸鈉顯著提高了肉雞糞便中乳酸的含量,這與腐殖酸鈉提高糞便中乳酸菌的數量有關。研究表明,乳酸可有效抑制致病菌的生長與繁殖,并降低其發酵含氮化合物所需蛋白酶的活性,減少畜禽糞便中的臭味物質的產生[37-38]。因此,腐殖酸鈉降低肉雞糞便中的含氮化合物的濃度,一方面是因為腐殖酸鈉具有較強的氮結合能力,另一方面是因為腐殖酸鈉抑制有害菌的生長與繁殖,降低發酵含氮化合物所需蛋白酶的活性,進而減少臭味物質的產生。

3.4 腐殖酸鈉對肉雞糞便中生物胺含量的影響

生物胺主要是微生物對氨基酸進行脫羧產生的一種有機堿性化合物,包括一元胺、二元胺和多胺[39-40]。例如,酪氨酸脫羧生成酪胺;精氨酸脫羧生成腐胺、亞精胺和精胺。高濃度酪胺、腐胺、亞精胺和精胺具有毒性,能引起高血糖、偏頭痛、腎衰竭和腫瘤在內的相關疾病[41]。何俊娜等[42]報道稱,腐殖酸可影響微生物對含氮化合物的代謝水平。本試驗結果顯示,日糧添加腐殖酸鈉可顯著降低肉雞糞便中酪胺、腐胺、亞精胺、精胺和總生物胺的濃度,表明腐殖酸鈉可抑制微生物對酪氨酸和精氨酸的脫羧反應,降低相關生物胺濃度。余苗等[34]研究表明,大腸桿菌等微生物具有代謝含氮化合物產生生物胺的能力。在本試驗中,日糧添加腐殖酸鈉顯著降低了肉雞糞便中大腸桿菌的數量,進一步驗證了腐殖酸鈉具有降低肉雞糞便中生物胺濃度的作用。

4 結 論

日糧添加腐殖酸鈉可提高肉雞對日糧中粗蛋白、磷和灰分的表觀消化率,促進糞便中乳酸菌的生長與繁殖,提高乳酸的濃度,抑制大腸桿菌的生長與繁殖;同時,降低糞便中氨態氮、對甲酚、腐胺、酪胺、亞精胺、精胺和總生物胺等臭味物質的濃度,達到源頭減排的目的,且在本試驗條件下添加0.5%的效果優于0.3%。