綿羊miR-200b啟動子鑒定及其對卵泡顆粒細胞線粒體功能的影響

宋鵬琰,王思偉, 2,岳巧嫻,張寅梁,陳曉勇,周榮艷*

(1.河北農業大學動物科技學院,保定 071001;2.河北省農林科學院糧油作物研究所,石家莊 050035)

microRNA(miRNA)是一種細胞內源性長度約18～24 nt的非編碼且高度保守的RNA[1],主要通過與靶基因3′-UTR的特異性堿基互補配對在轉錄后水平調控基因表達[2]。miRNA可調控細胞周期、增殖、凋亡等過程[3-4]。miR-200b屬于miR-200家族一員,可以參與激素合成和分泌、發情周期和排卵來調節雌性動物的繁殖。miR-200b和miR-200c可以靶向調控磷酸酶張力蛋白同源物的表達抑制人顆粒細胞KGN增殖[5]。miR-200b通過下調GNAQ反饋調控GnRH的表達來調控綿羊的發情過程[6]。敲除miR-200b和miR-429的雌性小鼠不排卵,且通過抑制ZEB1的表達來調節小鼠繁殖過程[7]。miR-200b-3p還可以靶向CYP19A1基因調控小鼠顆粒細胞類固醇激素的合成和分泌[8]。此外,miR-200b在哈薩克羊和湖羊發情期卵巢中表達顯著下調[9-10],在小尾寒羊卵巢黃體期與卵泡期表達水平存在差異,且黃體期高于卵泡期[11],在不同直徑綿羊卵泡中表達水平也有所差異[12],但其表達調控機制尚不明確。

NR4A1(Nur77、TR3或NGF1-B)作為核受體家族NR4A成員之一,可作為轉錄因子介導細胞凋亡[13-14]。NR4A1能夠調控卵泡發育[15]、抑制顆粒細胞增殖并促進顆粒細胞凋亡,且其與黃體退化密切相關[16-17]。通過靶基因和轉錄因子的預測,發現NR4A1基因3′-UTR不存在miR-200b的結合位點,但在miR-200b的啟動子區上存在NR4A1的結合位點,推測NR4A1能夠調控miR-200b的轉錄。為驗證這一假設,本研究鑒定了綿羊miR-200b核心啟動子區,檢測了NR4A1對miR-200b啟動子活性及其表達水平的影響,為miR-200b的上游轉錄機制提供了理論依據。

線粒體作為“能量工廠”,為細胞提供能量,調控細胞周期、增殖分化、信號傳導及細胞死亡過程[18]。細胞周期與線粒體功能協調互作[19],線粒體在細胞凋亡中起著至關重要的作用。細胞周期調節因子可以控制線粒體的生物發生、代謝活動及動力學,線粒體又可以為細胞周期提供所需能量[19]。線粒體功能異?？芍戮€粒體膜電位下降、ROS升高,導致細胞凋亡[20-21]。線粒體氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)是線粒體重要的代謝功能之一,OXPHOS缺陷導致線粒體膜電位降低,引起細胞啟動適應性反應[22]。miRNA通過靶基因參與細胞線粒體OXPHOS和ROS生成,調控細胞線粒體功能[23]。miR-211在調控細胞OXPHOS和線粒體能量代謝中起重要作用[24],miR-200a促進細胞線粒體伸長[25],miR-210調控線粒體電子傳遞鏈并刺激ROS產生[26]。抑制miR-23a可提高細胞線粒體膜電位并減少ROS產生,抑制細胞凋亡[27]。拮抗miR-107的表達可致細胞線粒體膜電位和電子傳遞鏈活性降低,引發線粒體失衡[28]。該團隊前期研究發現,miR-200b抑制綿羊卵泡顆粒細胞增殖并促進細胞凋亡[29],推測miR-200b是通過影響顆粒細胞線粒體功能進而發揮抑增殖和促凋亡的作用。因此,本試驗研究了miR-200b對綿羊卵泡顆粒細胞線粒體功能的影響,為闡明其抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM/F12培養基、胎牛血清FBS購自Thermo Fisher Scientific公司;miR-200b mimic和mimic NC合成于廣州銳博生物科技有限公司;SacⅠ、HindⅢ和PrimeScriptTM RT Reagent Kit購自TaKaRa公司;HiPerFect Transfection Reagent購自QIAGEN公司;LipofectamineTM2000和Mito-Tracker Red CMXRos購自Invitrogen公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司;無內毒素質粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;增強型線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)和增強型ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;ROS活性氧檢測試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司;綿羊線粒體呼吸鏈復合物 Ⅰ(Complex Ⅰ)ELISA試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司;Forget-Me-NotTMEvagreen?qPCR Master Mix購自美國Biotium公司。

1.2 顆粒細胞分離培養

在保定瑞麗肉食品有限公司采集綿羊(小尾寒羊)新鮮卵巢組織,立即放入含1%雙抗的37 ℃生理鹽水中,48 h內運回實驗室。清洗消毒后去除多余的脂肪和系膜,利用無菌刀片劃破卵泡(3～7 mm)釋放卵泡液混于培養基中,1 500 r·min-1離心10 min。PBS洗滌2次后,用含10% FBS,1%青霉素鏈霉素與50 μg·mL-1丙酮酸鈉的DMEM/F12培養基混勻顆粒細胞,并置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養[29]。

1.3 熒光素酶載體構建

在NCBI數據庫中下載綿羊miR-200b(ENSOARG00000023754,Chromosome 12,NC_040 263.1:55,091,437-55,091,495)啟動子區序列。利用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預測miR-200b的啟動子,設計特異性引物(表1),并以綿羊基因組DNA為模板進行擴增。PCR產物送北京擎科生物科技有限公司進行測序。利用限制性內切酶SacⅠ 和Hind Ⅲ將不同片段序列連接至pGL3-Basic載體上,經制備線性克隆載體、片段插入、PCR擴增及產物純化、克隆、轉化及陽性克隆檢測等過程,陽性克隆送至通用生物系統有限公司進行測序。提取測序鑒定后的陽性重組質粒用于細胞轉染,測定濃度后于-20 ℃保存。

表1 啟動子擴增引物Table 1 Primers used in promoter amplification

1.4 熒光素酶活性檢測

以每孔8×104個細胞的密度將顆粒細胞接種于24孔板,每孔加入500 μL細胞懸液,置于37 ℃、5% CO2培養箱中,當細胞匯合度達70%～90%時,按照質粒:LipofectamineTM2000為1∶2、pGL3-control:pRL-TK為99∶1的比例分別將pGL3-Basic、miR-200b啟動子重組質粒與內參載體pRL-TK共轉染至顆粒細胞中,每組3個重復。轉染48 h后,棄掉培養液,PBS洗滌2次,每孔加100 μL裂解液,室溫震蕩裂解10 min后轉移至1.5 mL離心管,8 000×g(4 ℃)離心10 min。每組取5 μL上清液,加20 μL 1×LARII,混勻后測定F(螢火蟲熒光素)值,再加20 μL 1×Stop &Glo Reagent,測定R(海腎熒光素酶)值。每孔檢測重復3次。

1.5 Mito-tracker Red CMXRos染色

將顆粒細胞接種于24孔板,每孔0.5 mL細胞懸液,每組3個重復,37 ℃預培養。用opti-M分別稀釋50 nmol·L-1miR-200b mimic和mimic NC,低速漩渦混勻,加入3 μL HiPerFect Transfection Reagent,低速漩渦混勻后室溫靜置10 min,然后將轉染復合體逐滴加至24孔板內。48 h后,棄掉培養基,加入25 nmol·L-1Mito-Tracker Red CMXRos工作液,37 ℃孵育30 min。棄掉工作液,PBS清洗3次。滴加Hoechst 33342染色液進行核染,室溫孵育10 min,PBS洗3次,棄掉液體,倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。然后將圖片用Image J進行光密度分析和細胞長度分析。

1.6 線粒體膜電位和ROS檢測

顆粒細胞轉染50 nmol·L-1miR-200b mimic和mimic NC,48 h后,棄掉培養基,PBS洗滌2次。然后分別按照線粒體膜電位檢測試劑盒和ROS檢測試劑盒說明書進行探針的裝載和檢測,并用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。圖片用Image J進行光密度分析。

1.7 ATP含量檢測

將顆粒細胞接種于6孔板,每孔2.3 mL細胞懸液,每組3個重復,37 ℃預培養。轉染50 nmol·L-1miR-200b mimic和mimic NC,48 h后收集上清液。每孔加240 μL裂解液,裂解細胞。裂解后4 ℃12 000×g離心5 min,取上清,放冰上待檢測。先在1.5 mL離心管內加入100 μL ATP檢測工作液,室溫放置5 min,以消耗本底ATP;然后向檢測孔內加20 μL樣品或標準品,吹打混勻,2 s后檢測RLU值。

1.8 線粒體復合物 Ⅰ 濃度檢測

ELISA用于檢測顆粒細胞上清液中線粒體復合物 Ⅰ 濃度。將步驟“1.5”中收集的細胞上清液3 000 r·min-1離心10 min。按ELISA試劑盒說明書進行配液和檢測,并利用酶標儀在450 nm處測定OD值,并根據標準曲線計算樣品線粒體復合物 Ⅰ 的濃度。

1.9 基因表達水平檢測

將顆粒細胞接種于6孔板,轉染50 nmol·L-1miR-200b mimic和mimic NC,48 h后收集細胞。首先利用TRIzolTMReagent提取RNA,然后利用PrimeScriptTMRT reagent kit進行反轉錄。具體步驟和體系如下:除去基因組DNA(RNA 800 μg,5×gDNA Reaction Buffer 2 μL,gDNA Eraser 1 μL,RNase-free dH2O 補至10 μL,42 ℃孵育2 min,4 ℃保存),以及反轉錄(上述反應液 10 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL,RT Primer Mix 1 μL,5×PrimeScript Buffer 4 μL,RNase Free dH2O 4 μL。輕輕混勻,37 ℃孵育15 min,85 ℃加熱失活5 s,產物-20 ℃保存)。最后利用Forget-Me-NotTMEvagreen?qPCR Master Mix進行qRT-PCR,反應體系:2×Forget-Me-NotTM qPCR Master Mix 10 μL,Forget-Me-Not EvaGreen ROX Reference Dye 3 μL,RNase-free dH2O 4.2 μL,cDNA 2 μL,Forward Primer 0.4 μL,Reverse Primer 0.4 μL。反應條件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 5 s共40個循環。數據采用2-ΔΔCt方法進行計算。引物序列詳見表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 qRT-PCR primer sequences

1.10 統計分析

所有數據均用SPSS 22.0進行統計分析。判斷每組數據是否符合正態分布,若符合正態分布,則采用獨立樣本t檢驗;若不符合則采用非參數檢驗(Mann-Whitney U檢驗)。利用GraphPad Prism 8軟件作圖。所有結果以“平均數±標準差(Mean±SD)”表示,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 綿羊miR-200b核心啟動子區的鑒定

利用pGL3-Basic質粒構建miR-200b啟動子區不同長度片段的熒光素酶表達載體miR-200b-P1(-159/+36 nt)、miR-200b-P2(-339/+36 nt)和miR-200b-P3(-581/+36 nt)。將不同長度片段重組質粒分別轉染至綿羊卵泡顆粒細胞中,48 h后收集細胞,化學發光法檢測雙熒光素酶活性。如圖1所示,miR-200b-P1的熒光素酶活性分別極顯著高于空載體pGL3-Basic和其他片段(P<0.01),表明其為綿羊miR-200b的核心啟動子。利用在線軟件JASPAR(https://jaspar2018.genereg.net/analysis)預測綿羊miR-200b-P1序列中存在1個轉錄因子NR4A1結合位點(圖2)。

**.P<0.01,下同**.P<0.01, the same as below圖1 綿羊miR-200b啟動子區不同缺失載體的相對熒光素酶活性Fig.1 The relative luciferase activity of different deletion vectors of oar-miR-200b promoter

2.2 NR4A1促進綿羊miR-200b的轉錄

將實驗室保存的NR4A1過表達載體(pcDNA3.1-NR4A1)與miR-200b-P1共轉染至綿羊卵泡顆粒細胞中,48 h后收集細胞并進行雙熒光素酶活性檢測。過表達NR4A1的顆粒細胞中miR-200b-P1啟動子活性極顯著升高(P<0.01,圖3A)。與pcDNA3.1組相比,NR4A1過表達的顆粒細胞中miR-200b表達水平極顯著上調(P<0.01,圖3B)。以上結果說明,NR4A1可促進綿羊miR-200b的轉錄。

A. miR-200b-P1啟動子區活性;B. miR-200b相對表達量A. The promoter activity of miR-200b-P1; B. Relative expression of miR-200b圖3 綿羊miR-200b核心啟動子活性及其相對表達水平Fig.3 The core promoter activity and relative expression of oar-miR-200b

2.3 miR-200b對顆粒細胞線粒體形態和數量的影響

通過Mito-Tracker Red CMXRos染色(圖4A)發現,與mimic NC組相比,miR-200b mimic組的顆粒細胞線粒體發生皺縮。經統計分析,miR-200b mimic處理組顆粒細胞平均光密度顯著降低(P<0.01,圖4B),線粒體數量減少,且細胞長度顯著縮短(P<0.01,圖4C)。

2.4 miR-200b對顆粒細胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體的基質中,形成JC-1聚合物(JC-1 aggregates),產生紅色熒光;線粒體膜電位較低時,JC-1不能聚集在線粒體的基質中,以JC-1單體(JC-1 monomer)形式存在,產生綠色熒光;JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變,說明細胞線粒體膜電位下降,也是細胞早期凋亡的標志性事件。與mimic NC組相比,miR-200b mimic組的顆粒細胞綠色熒光顯著增強,且紅色熒光與綠色熒光比值顯著降低(P<0.05,圖5A),說明顆粒細胞中JC-1單體明顯增多,線粒體膜電位下降。

A. 線粒體膜電位染色(200×)及紅色熒光與綠色熒光相對比值;B. ATP含量;C. ROS水平;D. 線粒體呼吸鏈復合物 Ⅰ 濃度。*.P<0.05A. Staining in mitochondrial membrane potential (200×) and relative RFP/GFP ratio; B. The content of ATP; C. The level of ROS; D. The concentration of mitochondrial respiratory chain complex I. *.P<0.05圖5 過表達miR-200b的綿羊卵泡顆粒細胞線粒體膜電位及氧化磷酸化相關指標變化Fig.5 Changes in mitochondrial membrane potential and OXPHOS-related indicators in ovine follicular granulosa cells with overexpression of miR-200b

2.5 miR-200b對顆粒細胞線粒體氧化磷酸化及相關基因表達的影響

與mimic NC組相比,miR-200b mimic組的顆粒細胞ATP含量(P<0.05,圖5B)和線粒體呼吸鏈復合物 Ⅰ 的濃度(P<0.01,圖5D)顯著降低,ROS水平極顯著升高(P<0.01,圖5C)。此外,miR-200b mimic極顯著下調顆粒細胞線粒體氧化磷酸化相關基因NDUFV1(P<0.01, 圖6A)和ATP6V1G1(P<0.01, 圖6B)基因的表達水平,并極顯著上調NOX4基因的表達水平(P<0.01, 圖6C)。

圖6 綿羊卵泡顆粒細胞中線粒體氧化磷酸化相關基因的表達水平Fig.6 The expression level of mitochondrial OXPHOS related genes in ovine follicular granulosa cells

3 討 論

miRNA主要通過與靶基因3′-UTR結合發揮其對基因下游的調控功能,但miRNA的轉錄及其上游調控機制研究也很重要。一些miRNAs位于基因內含子區域,與宿主基因享有相同的轉錄調控元件,但大部分miRNA具有自己的啟動子[2]。因此,研究miRNA的啟動子有助于揭示miRNA自身的轉錄調控過程。轉錄因子在動物細胞內廣泛存在,能通過準確識別并結合到特異的DNA片段來發揮轉錄調控作用[30]。許多轉錄因子可調控miRNA的轉錄。CCAAT/增強子結合蛋白a可作用于miR-130a和miR-130b基因的啟動子分別顯著抑制和促進miRNA的啟動子活性[31]。TGFβ1可調控miR-224啟動子區域誘導miR-224的轉錄[32]。ZEB1和ZEB2可直接結合miR-200s 啟動子區抑制其轉錄[33]。轉錄因子結合位點是轉錄因子在轉錄水平調控基因表達時結合的靶基因啟動子的特殊位點[34],轉錄因子通過結合在miRNA啟動子區域的轉錄因子結合位點上調控miRNA表達。本研究明確了綿羊miR-200b核心啟動子區(-159/+36 nt),證實NR4A1影響miR-200b核心啟動子的活性及其表達水平,促進miR-200b的轉錄。

NR4A(nuclear receptor subfamily 4 group A member)家族是一類及早反應基因家族[35],主要由NR4A1、NR4A2和NR4A3組成。NR4A涉及細胞生長、生存和凋亡,主要源于3種生化特性:1)作為轉錄因子,激活上調介導細胞增殖和存活的靶基因表達;2)作為轉錄因子,激活上調導致細胞凋亡的靶基因表達;3)移位至胞質并靶向定位于線粒體觸發凋亡[13-14]。NR4A1在動物組織中廣泛表達,并在卵巢組織中主要定位于卵泡膜細胞、黃體細胞和顆粒細胞[17,36-37],調控雌性動物卵巢功能和卵泡發育。NR4A1可作為miRNA(如miR-204-5p[38]、miR-506[39])下游靶基因發揮作用。然而,NR4A1基因3′-UTR與綿羊miR-200b間不存在靶向結合位點,因此二者不存在靶向關系。NR4A1作為轉錄因子可以調控多種RNAs的轉錄。NR4A1在黃體細胞中高表達[37],miR-200b在黃體期卵巢中表達上調[11],且二者都能抑制顆粒細胞增殖并促進細胞凋亡[16,29],推測NR4A1可調控miR-200b的轉錄。在本研究中,綿羊miR-200b核心啟動子上存在NR4A1的結合位點,且過表達NR4A1提高了miR-200b的啟動子活性和表達水平,證實NR4A1能夠正向調控綿羊miR-200b的轉錄。

miR-200b過表達顯著下調細胞周期相關基因表達抑制綿羊卵泡顆粒細胞增殖,同時顯著下調Bcl-2的表達水平促進顆粒細胞凋亡[29]。線粒體在細胞周期和凋亡中扮演著重要作用[18]。細胞周期重要調控因子CDK1和Cyclin B,其蛋白定位于線粒體基質上,可磷酸化呼吸鏈復合物 Ⅰ 亞基,復合物被激活,可促進OXPHOS為G2/M期轉化提供充足的ATP[40]。Bcl-2家族成員可驅動線粒體外膜透化,導致凋亡誘導因子和半胱天冬酶通路激活所介導的細胞凋亡[41-43]。半胱天冬酶通路與線粒體損傷相關,伴隨電子傳遞的破壞、OXPHOS、ATP產生和氧化還原電位變化[21,44]。本研究發現,在顆粒細胞中過表達miR-200b導致線粒體功能異常,包括線粒體皺縮、線粒體膜電位下降、ATP含量降低,以及ROS水平提高。線粒體結構的完整性與形態維持對其功能發揮起著至關重要的作用,且線粒體通過OXPHOS產生ATP[45],而ROS是觸發顆粒細胞凋亡所必需的[46]。通過檢測發現,miR-200b過表達導致顆粒細胞線粒體呼吸鏈體復合物 Ⅰ 的濃度降低,且下調了參與復合物 Ⅰ 模塊組裝的關鍵基因NDUFV1的表達。同時,與ATP生成相關基因ATP6V1G1的表達水平也發生異常,且上調與ROS產生相關基因NOX4的表達。所有這些結果相互一致,表明miR-200b可負調控綿羊卵泡顆粒細胞OXPHOS,導致細胞線粒體功能異常,進而能夠抑制顆粒細胞增殖并促進細胞凋亡。

4 結 論

綿羊miR-200b的核心啟動子區為-159/+36 nt,NR4A1正向調控miR-200b的轉錄,且miR-200b抑制綿羊卵泡顆粒細胞氧化磷酸化過程,誘導顆粒細胞線粒體損傷。本研究為進一步揭示miR-200b調控綿羊卵泡發育的作用機制提供了理論依據。