微流體技術在家畜體外胚胎生產中的應用進展

陳思潁,孫雅雯,李 伉,劉 碩,郝海生,杜衛華,鄒惠影,朱化彬,龐云渭

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193)

家畜體外胚胎生產(invitroembryo production,IVEP)技術體系包括卵母細胞體外成熟、體外受精(invitrofertilization,IVF)、胚胎體外培養和超低溫冷凍保存等若干技術環節,是一個極為復雜的集成技術體系[1-2]。該技術在良種母畜繁殖潛力挖掘、快速擴繁以及種質資源保護等方面均具有重要的應用價值。近20年來,全球體外胚胎生產數量持續攀升,IVEP技術已成為當前國際家畜繁育技術競爭的新賽道。然而,與體內胚胎相比,體外胚胎生產仍存在卵母細胞成熟質量差、體外胚胎發育能力弱以及抗凍性差等問題,嚴重制約IVEP技術體系總體效率提升。

微流體學既是一門科學,也是一種技術。從科學上講,它是利用數十微米至數百微米的微流控通道精確控制和操縱亞微升流體(10-9～10-18L)行為的研究[3-4];在技術上,它涉及分析、診斷、細胞生物學和單細胞基因組學的應用,是一個包含工程、物理、化學和生物學的多學科和跨學科研究領域。以層流和低雷諾數為特征對微流體進行操縱的過程稱為微流控[4],由于微流控裝置具有樣品消耗少、分析速度快、高通量、高靈敏度、高自動化和集成化等特點[3,5],其在家畜體外胚胎生產多個關鍵技術環節中顯示出巨大的應用前景[6]。本文綜述了近年來微流體技術在卵母細胞選擇、精子分選、IVF集成、胚胎體外培養以及配子和胚胎超低溫冷凍保存中的應用進展,為提升家畜IVEP效率提供新思路。

1 微流體技術在卵母細胞選擇中的應用

在IVEP中,卵母細胞的選擇取決于對細胞質、極體和卵丘細胞的形態學評估,體外停留時間長且主觀性較強。而微流體技術可以對卵母細胞進行自動化處理和制備,從而最大限度地降低卵母細胞的損傷[7]。Iwasaki等[8]為了提高IVF效率,根據不同質量卵母細胞在蔗糖緩沖液中的沉降速率差異,設計了一種篩選牛卵母細胞的微流控裝置(圖1A)。分離通道的出口分為上腔室和下腔室。在蔗糖緩沖液中,優質卵母細胞比劣質卵母細胞沉降得更快,因此,從下腔室收集到的卵母細胞質量較好,且優質卵母細胞回收率可達55%左右。對分離的卵母細胞分別進行IVF后發現,從下腔室收集的卵母細胞囊胚發育率顯著高于從上腔室收集的卵母細胞(36.0% &14.1%)。

A.分離卵母細胞的微流控裝置;B.培養卵母細胞的微流控裝置 A. Microfluidic device for oocyte seperation;B. Microfluidic device for oocyte cultivation 圖1 用于卵母細胞選擇和培養的微流控裝置示意圖[8,10]Fig.1 Schematic of microfluidic device for oocyte seperation and cultivation[8,10]

與傳統的靜態體外培養卵母細胞相比,采用微流控裝置構建的動態培養系統可更好地模擬體內生理環境[9]。Berenguel-Alonso等[10]以環烯烴聚合物和低溫共燒陶瓷為材料,采用熱壓和微銑削相結合的方法制作了一種捕獲和選擇牛卵母細胞的微流控裝置(圖1B)。該裝置中“過濾器狀”結構用于捕獲卵母細胞,使卵母細胞固定在成熟室避免丟失,并通過相連的微銑腔運輸培養液,從而進行動態培養。采用該裝置培養的卵母細胞成熟率與傳統四孔板培養無顯著差異,但使用該裝置進行的動態培養有助于提高卵母細胞的整體成熟度。借助流體力學分析和3D生物打印模型,Mastrorocco等[11-12]構建了基于藻酸鹽填充的微流控裝置用于羔羊卵母細胞體外成熟,發現經動態培養系統培養的卵母細胞,核質成熟、生物能量和囊胚發育質量均有所改善,并且此法可用于培養瀕危物種、老年供體或冷凍保存后等次優條件下的卵母細胞。

2 微流體技術在精子分選中的應用

有效分選以獲得足夠數量形態正常且有活力的精子對IVF至關重要[13]。與傳統精子處理方法相比,微流控裝置能夠快速精確地分離出高質量精子,在不影響精子形態的前提下改善精子動力學參數,降低DNA 碎片水平[14],具有標準化高、靈活性和可控性強等優點[15]。

Nagata等[16]開發了一種具有超高選擇通量,且能夠篩選DNA完整性高、運動力強且的牛精子的擴散型微流控分選裝置(diffuser-type microfluidic sperm sorter,DMSS),由3個柱形腔室和底部14個微通道構成(圖2A),根據3個腔室的不同尺寸和液柱相對高度差產生的靜水壓使精子通過微通道進行分選。其結果顯示,DMSS分選的精子活力和直線運動比例達到100%,DNA完整率達到95%以上。Yaghoobi等[17]設計了一種基于微腔的微流控裝置(圖2B),可將漸進運動的精子與不活動精子及其碎片分離,并將非漸進精子捕獲在微腔室中。經過該裝置分選出的牛精子活力從38%提升至90%,DNA完整性提高了近20%,并且微腔深度不影響運動精子的停留時間,可在相同的時間范圍內分選更多數量的精子。

A.擴散型精子分選裝置;B.基于微腔的精子分選裝置A. A diffuser-type microfluidic sperm sorter; B. Microchamber-based microfluidic device for sperm selection圖2 用于精子分選的微流控裝置示意圖[16-17]Fig.2 Schematic of microfluidic device for sperm selection[16-17]

為了全面評價精子質量,Pan等[18]開發了一種可以自動混合樣品的微流控芯片,并配備便攜式顯微成像系統進行實時觀察,提出了一套識別精子活力和存活率的算法。采用該裝置檢測豬存活精子的準確率為94.0%,誤差率僅為0.6%,與計算機輔助精子分析結果一致。Herbicht等[19]提出了一種新型微流控芯片式精液處理裝置(VetCountTM收集器)用于牛IVF,并與不連續密度梯度離心法進行比較,分別對來自6頭不同公牛的冷凍-解凍精液質量進行評估后發現,與未處理組相比,兩種處理均顯著增加了漸進運動精子的比例(84.4% &85.1%vs.41.9%);IVF試驗發現,采用VetCountTM收集器篩選的2頭公牛精子的受精效果要優于不連續密度梯度離心處理法,但這種能力因公牛而異。Alkan等[20]評估了微流控精子分選芯片(microfluidic sperm sorting chip,MFSC)對牛IVEP胚胎發育和質量的影響,發現MFSC組IVF卵裂率(85.71%vs. 76.33%)、囊胚率(44.15%vs. 32.54%)均顯著高于常規精子處理組,囊胚總細胞數、內細胞團數、滋養層細胞數明顯增加,且凋亡細胞比例顯著減少,表明MFSC可替代常規精子處理方案提高牛IVEP效率。此外,Vigolo等[21]采用商業化的ZyMot多精子分離裝置測定種馬精液的分選效果,在微流體回收前、后對精子的運動學參數、質膜和頂體完整性、線粒體膜電位等進行評估,發現該裝置對質量較差的種馬冷凍精液分選效果更好,可用于特定精子群體的篩選。

3 微流體技術在IVF中的集成應用

常規IVF是將卵母細胞放置在培養皿中,加入適宜濃度的精子使其自然穿透卵母細胞,但這常會導致多精受精的發生,致使胚胎染色體異常[22-23],而且配子和胚胎在整個操作過程中會多次受到溫度、二氧化碳濃度和氧張力波動的影響[24];同時,操作人員技術的差異也使IVF難以實現標準化[25]。而集成多種IVF操作程序的微流控裝置可以減少人為操作的干預,提高生產效率。

Clark等[26]模仿輸卵管功能設計了一款微通道,在層流狀態下用于將精子輸送至卵母細胞。研究發現,與傳統微滴系統相比,豬卵母細胞在微通道中的單精受精率(63.89%vs.22.32%)顯著提高。這表明該仿生微通道可降低多精受精的發生率,增加存活胚胎的數量,并且不會降低體外胚胎整體生產效率。Han等[27]報道了一種新型微孔結構的微流體裝置,采用微孔陣列在流場中捕獲單個卵母細胞,并進行原位受精、培養基置換和胚胎培養(圖3A)。通過有限元建模和流動洗滌實驗比較了不同的微孔深度,發現在快速原位培養基更換過程中,高達200 μm的微孔深度在卵母細胞捕獲和碎片去除方面最有效,有助于受精和胚胎培養在單個微流體裝置中的集成。采用該裝置培養的胚胎各階段的發育率與微滴培養相似。此外,通過改變微腔的寬度和深度,該裝置還可用于培養不同物種的卵母細胞和胚胎。袁一田[28]設計制作了集成精子篩選、受精、胚胎培養的集成微流控芯片(圖3B),用于豬IVF試驗,發現IVF囊胚率從5.4%提高到10.3%。該研究證明了微流控芯片在優化豬IVF體系中的有效性。Ma等[29]開發了一種集成卵母細胞定位、精子分選、體外受精、胚胎培養等多功能的微流控芯片(圖3C)。卵母細胞可單獨定位在4×4的八柱單元陣列中,4個對稱的直通道在卵母細胞定位區交叉以有效地選擇運動精子,并有助于快速更換培養基。采用該裝置篩選的精子活力顯著高于傳統離心法(96.1%vs.60.8%),但卵裂率和囊胚發育率與傳統IVF培養方式無顯著差異。

A.新型微孔結構的微流控裝置;B. 多層微流控裝置;C.多功能微流控芯片A. A novel microwell-structured microfluidic device; B. Multilayer microfluidic device; C. Multifunctional microfluidic chip圖3 用于體外受精的微流控裝置示意圖[27-29]Fig.3 Schematic of microfluidic device for in vitro fertilization[27-29]

4 微流體技術在胚胎體外培養中的應用

早期胚胎的體外培養是胚胎工程的關鍵環節之一。目前,IVEP效率低的主要原因之一是胚胎體外培養體系仍無法完全模擬雌性生殖道微環境,造成囊胚發育率低、胚胎質量差以及移植妊娠率低等一系列問題[2]。微流體系統將3D架構、不同類型的細胞[30-31]和流動流體結合起來,可創造一個動態的胚胎體外培養系統[32],持續為胚胎提供新鮮的營養物質,同時去除胚胎產生的有毒物質,從而改善體外胚胎發育質量[33]。

Bormann等[34]將牛體外胚胎隨機在傳統培養微滴和具有動態流體的微流控裝置中進行培養,發現微流控裝置培養的體外胚胎囊胚發育率顯著高于傳統液滴培養(35.0%vs.21.4%)。Kim等[35]開發了一種用于牛胚胎體外培養的微流控裝置,采用傳統的光刻和聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)復制成型工藝制作無收縮功能的直通道或通過模擬肌肉的蠕動性收縮構建具有收縮功能的微通道,將受精卵在微流體培養系統上培養,發現采用具有收縮功能的微流控裝置產生的8-細胞胚胎比例顯著高于直通道(56.7%vs.23.9%)。上述結果表明,動態培養環境以及機械刺激可促進早期胚胎的體外發育。

20世紀90年代出現的介質電潤濕(electrowetting on dielectric, EWOD)技術催生了被稱作數字微流控(digital microfluidics,DMF)的微尺度液體處理技術,EWOD能夠提供胚胎發育所需的動態培養微環境,更好地模擬輸卵管功能[36]。到目前為止,EWOD芯片僅被用于小鼠胚胎的體外動態培養[37-38]和人類早期胚胎發育的非侵入性評估工具[39]。最近,Karcz等[40]利用EWOD技術設計了一種用于體外操縱牛胚胎的微流控芯片,發現采用EWOD芯片培養的胚胎出現發育遲緩的跡象,與傳統靜態培養相比,在第8天(192 hpi)僅達到早期囊胚階段。盡管沒有達到預期結果,但該研究使DMF成為真正的芯片實驗室成為可能,并為開發更多用于體外胚胎操作的仿生微型設備提供理論基礎。

5 微流體技術在超低溫冷凍保存中的應用

早期研究發現,在玻璃化冷凍-解凍過程中添加和移除冷凍保護劑(cryoprotectant agents, CPAs)會導致滲透和機械損傷以及細胞毒性[41-42],直接影響卵母細胞和胚胎的發育能力[43-46]。而微流體技術可使CPAs在微流控芯片中保持緩慢而穩定的流速,實現CPAs穩步添加和移除[47],降低細胞損傷[48-49],提高發育率[50-52]。

Lai等[53]利用高度差驅動CPAs開發了自動玻璃化微流控裝置。與手動操作相比,該裝置將卵母細胞和受精卵的收縮率降低了13.8倍,顯著增加了玻璃化冷凍-解凍后牛卵母細胞中的脂質含量,降低了滲透損傷,獲得更好形態、更高存活率和發育率的牛卵母細胞。衣星越等[54]設計了一種用于豬MⅡ期卵母細胞CPAs添加和移除的微流控芯片(圖4A),并分析了CPAs移除時間對卵母細胞存活和體外發育能力的影響,發現微流控裝置移除CPAs總時間為8 min時,卵母細胞存活率和桑椹胚率(95.99% &74.17%)與新鮮組相比(98.53% &78.22%)無顯著差異,表明采用微流控法移除CPAs能夠降低卵母細胞損傷。Guo等[55]采用微流控法實現連續添加和移除豬MⅡ期卵母細胞中的CPAs,發現微流控法處理的卵母細胞體積變化明顯小于分步法,卵母細胞存活率(95.3%vs.79.4%)、卵裂率(64.4%vs. 43.6%)和囊胚率(19.4%vs.9.7%)顯著提高。Cai等[56]開發了一種壓力觸發式微流控芯片(圖4B)。通過按壓壓力變形區頂部壓力點改變微通道橫截面來控制添加和移除CPAs的時間,該芯片簡化了添加和移除CPAs的操作過程,降低了對卵母細胞的損傷。Jiang等[52]以環烯烴聚合物為基質設計了具有微柱陣列的微流控裝置。與微通道微流控芯片相比,該裝置提高了液體交換效率、減少了液體殘留、加快了卵母細胞在液氮中的冷卻速率,使其能承受液氮和室溫的溫差沖擊,還避免了冷凍過程中卵母細胞體積的快速變化,在保持卵母細胞原有形態的同時,降低滲透損傷,提高冷凍效率。以上裝置都可以通過改變微流控芯片的材料和微通道的尺寸,以適用不同物種卵母細胞的冷凍保存。

A.蛇行通道微流控裝置;B.壓力觸發式微流控芯片;C.液壓型微流控裝置A. Serpentine channel-based microfluidic device;B. Push-triggered microfluidic chip; C. Hydraulic microfluidic device圖4 用于添加和去除CPAs溶液的微流控裝置示意圖[49,54-56]Fig.4 Schematic of microfluidic device for CPAs addition and removal[49,54-56]

微流體技術在胚胎玻璃化冷凍保存方面的進展相對緩慢。Pyne等[57]首次開發了DMF裝置以實現玻璃化冷凍胚胎的自動制備,與傳統手動法和基于通道的玻璃化微流控裝置相比,DMF裝置能最大限度地減少胚胎與外界空氣的接觸,并且在整個玻璃化過程中不斷跟蹤和控制胚胎的位置,避免丟失。采用該裝置對胚胎進行玻璃化冷凍-解凍后,胚胎的存活率和發育率與傳統手動法無顯著差異。Tirgar等[49]利用靜水壓力差驅動CPAs設計了一種多通道微流控芯片(圖4C),并分析了CPAs添加時間對囊胚發育的影響。結果發現,采用該裝置添加CPAs的時間保持在12 min時最有利于解凍后囊胚的發育;與兩步法解凍相比,使用該裝置解凍后的胚胎仍能保持原有形態,并且與內質網應激、氧化應激、熱休克和細胞凋亡等相關的有害基因的表達降低。Miao等[58]設計了一個可自動進行胚胎玻璃化的機器人系統,包括CPAs預處理、將胚胎轉移到玻璃化細管以及用液氮進行冷凍保存。采用該系統解凍后胚胎的存活率(90.9%vs.94.4%)和發育率(90.0%vs.94.1%)與人工操作無顯著差異,該研究對實現自動玻璃化冷凍胚胎標準化具有重要的借鑒意義。

6 結論和展望

近年來,微流體技術在體外胚胎生產領域的應用取得重大進展。從混合的T型通道、蛇形通道到基于液滴的平面微流控裝置,微流體技術的應用越來越多樣化。與傳統手動操作相比,微流控裝置具有低消耗、快響應以及高度集成等特性,使其在IVEP的各個領域發揮重要作用。同時,采用微流控裝置可以提高操作過程標準化,減少人為因素的干預以及由此產生的誤差和污染[33],提高后續相關操作的成功率[59]。然而,由于微流控芯片的通道、接口設計以及材料加工工藝等缺乏統一標準,目前微流體技術的應用還僅限于動物實驗水平;而且,多數微流控裝置只能對單個細胞進行操作,效率較低;微流控裝置中的閥門、連接管道和注射泵等設備不便于進行胚胎操作。微流控芯片采用的載體大多為PDMS,為了芯片的集成性能,應采用高導熱材料作為替代[55],也可以使用封閉式載體系統替代開放式載體系統以提高芯片安全性,避免交叉感染[60]。

總之,微流體技術在卵母細胞選擇培養、精子分選、體外受精、體外胚胎培養以及配子和胚胎超低溫冷凍保存中的應用已日漸成熟,隨著該技術的進一步發展和優化,設計出高度集成的微流控芯片,實現體外胚胎生產的自動化操作,對提高IVEP技術效率具有重要意義。