基于超高效液相色譜-質譜聯用法的過敏煎、加味過敏煎大鼠血清差異代謝物分析*

韋 唯，譚冰燕，朱 禹，萬 李，吳賢波△

1.貴州中醫藥大學（貴陽 550001）；2.成都體育學院（成都 610041）

過敏煎出自《祝諶予經驗集》的經驗方，用于治療蕁麻疹、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、濕疹等過敏性疾病[1]。“以皮治皮”源于中醫“取象比類”的思想，以動植物的皮部入藥治療皮膚病，是中醫藥治療皮膚病的一大特色，歐陽恒[2]、艾儒棣[3]、韓世榮[4]等教授運用此法治療各類皮膚病并取得了良好的療效。加味過敏煎是吳賢波教授在“以皮治皮”理論指導下，于過敏煎基礎上加白鮮皮、蟬蛻組成，主要用于治療各種過敏性疾病。

代謝組學是系統生物學的組成部分，是通過系統研究新陳代謝動態過程中代謝產物的變化規律，從而揭示機體生命活動代謝本質[5]，主要分為靶向、非靶向代謝組學。其中，非靶向分析模式能夠將生物體內代謝水平的擾動情況最大程度反映出來，側重于系統性和整體性分析。

課題組前期研究[6]發現，臨床上加味過敏煎改善瘙癢癥狀等方面優于過敏煎（P＜0.05）；動物實驗[7]也證實，加味過敏煎改善特應性皮炎小鼠模型瘙癢、皮損等方面作用明顯優于過敏煎（P＜0.05）。研究結果提示，在“以皮治皮”理論指導下，加味過敏煎治療過敏性皮膚病瘙癢癥狀的效果優于過敏煎。本文擬在前期研究基礎上，通過非靶向代謝組的方法研究過敏煎、加味過敏煎大鼠灌胃后其血清的差異代謝物，采用生物信息學方法分析差異代謝物的種類、調控機制及功能作用等，為進一步研究加味過敏煎緩解瘙癢癥狀的機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器

Vanquish超高效液相、Orbitrap Exploris 120高分辨質譜、Heraeus Fresco17離心機（Thermo Fisher Scientific，美國）；BSA124S-CW天平（Sartorius，德國）；JXFSTPRP-24研磨儀（上海凈信科技有限公司）；明澈 D24 UV純水儀（Merck Millipore，德國）；YM-080S超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司）；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）（沃特斯公司，美國）。

1.2 材料

甲醇 （色譜純，CNW Technologies，德國，批號 67-56-1）；乙腈（色譜純，CNW Technologies，德國，批號 75-05-8）；甲酸（色譜純，Sigma，美國，批號 64-18-6）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司，批號103616-89-3）。

過敏煎、加味過敏煎處方所需的藥材飲片均符合2020 版《中國藥典》質控標準。防風（安國祁安藥業有限公司，批號：201204）；烏梅[北京本草方源（亳州）藥業科技有限公司，批號：220701]；銀柴胡[北京本草方源（亳州）藥業科技有限公司，批號：210401]；五味子（河北楚風中藥飲片有限公司，批號：B22060702-01）；甘草[北京本草方源（亳州）藥業科技有限公司，批號：220501]；蟬蛻（黃岡金貴中藥產業發展有限公司，批號：D22020101）；白鮮皮（北京仟草中藥飲片有限公司，批號：211005001）。備齊處方中所需的藥材，委托福州凍干粉制備實驗室完成凍干粉制備。

1.3 動物

健康的雄性SD大鼠，SPF級，體重（200±10）g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（川）2020-030。實驗大鼠適應性飼養3 d后進行正式實驗。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）（沃特斯公司，美國），進樣量：2 μL；分析柱保持在30 ℃，進樣器樣品盤15 ℃，用0.1%（v/v）甲酸水溶液（溶劑B）和乙腈（溶劑A）進行梯度洗脫。

1.4.2 質樸條件 正離子模式：電噴霧電離（electrosprayionization，ESI）；離源霧電壓：3 800 V；毛細管溫度：320 ℃；鞘氣流速：45 Arb；輔助氣流速：15 Arb；掃描范圍：70～1 000 m/z；分步碰撞能量的強度取值：3；分步碰撞能量：20、40、60 eV；掃描速率均為7 Hz。負離子模式：ESI；離源霧電壓：-3 100 V；毛細管溫度：320 ℃；鞘氣流速：45 Arb；輔助氣流速：15 Arb；掃描范圍：70～1 000 m/z；分步碰撞能量的強度取值：3；分步碰撞能量：20、40、60 eV；掃描速率均為7 Hz。在兩種離子模式下，均進行一級（分辨率：70 000）、二級（分辨率：17 500）質譜數據采集，獲取代謝原始數據。

1.4.3 血清樣品采集 取SD大鼠6只，適應性喂養3 d后，隨機分為過敏煎組、加味過敏煎組，每組3 只。過敏煎組以生藥量72.38 g/kg作為給藥劑量進行灌胃給藥，加味過敏煎組以生藥量81.00 g/kg作為給藥劑量進行灌胃給藥。早、中、晚各給藥1次，連續給藥3 d，末次給藥前12 h禁食不禁水。分別于末次給藥后60 min從大鼠腹主動脈采集血樣，常溫放置血樣1 h，待其凝固分層后，在室溫下以轉速3 000 r/min，離心半徑 8.6 cm，離心10 min，取上清液，4 ℃以轉速12 000 r/min，離心半徑8.6 cm，離心10 min，再次取上清，分裝于1.5 mL離心管中，每管0.2 mL，凍存于-80 ℃冰箱中。

1.4.4 血清樣品處理 將40 μL鹽酸（2 mol/L）加入400 μL的血清樣本中，進行1 min的渦旋混合，于4 ℃環境下靜置15 min，重復該步驟4 次；隨后注入1.6 mL的乙腈，進行5 min的渦旋混合，以轉速12 000 r/min，離心半徑8.6 cm，離心5 min，取上清1 800 μL，氮吹干燥；加入150 μL 80%甲醇（內標濃度為10 mg/L）復溶，渦旋5 min，以轉速12 000 r/min，離心半徑8.6 cm，離心5 min；吸取120 μL上清液，放入進樣瓶中上機檢測。1.4.5 數據分析 采集過敏煎血清和加味過敏煎血清在“1.4.1”項、“1.4.2”項條件下的數據。使用XCMS網站（https：//xcmsonline.scripps.edu），將質譜原始數據導入并處理。處理過程包括保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等。在鑒定含有二級碎片離子信息數據的峰的化合物時，利用上海百趣生物醫學科技有限公司提供的二級質譜數據庫和相應裂解規律匹配方法。

2 結果

2.1 主成分分析

對過敏煎含藥血清和加味過敏煎含藥血清進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。圖中的1 個點代表1 個樣本，藍色點代表過敏煎含藥血清，黃色點代表加味過敏煎含藥血清。從圖中可以看出，兩組的樣本分別有一定的聚集成群趨勢，這說明過敏煎含藥血清和加味過敏煎含藥血清的代謝物存在明顯差異。本次數據質量高，檢測性好，所采集的數據可以進行下一步分析（圖1）。

表1 差異代謝物差異倍數Top20 鑒定結果

圖1 過敏煎和加味過敏煎的PCA得分圖

2.2 正交偏最小二乘法-判別分析

通過SIMCA （V16.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，瑞典）軟件對數據進行預處理。首先對數據進行對數轉換，以及數據中心化后除以列變量標準差；然后用正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA）建模，對第一主成分進行分析，再用7折交叉驗證檢驗模型的質量；利用交叉驗證得到R2Y（模型對分類變量Y的可解釋性）和Q2（模型的可預測性），然后用R2Y和Q2對模型的有效性進行評判；最后通過置換檢驗得到不同的隨機Q2值，從而對模型的有效性做進一步檢驗。正離子、負離子模式下，樣本在空間位置上聚類明顯，分成兩組，表明OPLS-DA模型穩定可靠，組間有明顯差異。置換檢驗結果顯示，置換保留度與隨機模型的R2、Q2呈正比，說明模型穩健性良好，不存在過擬合現象（圖2～3）。

圖2 過敏煎和加味過敏煎的PCA得分圖

圖3 過敏煎和加味過敏煎的置換檢驗圖

2.3 差異代謝物篩選

將差異倍數（fold change，FC）＞1.2 或＜0.83，變量投影重要度（variable mportance in the projection，VIP）＞1 且P＜0.05 作為篩選標準，篩選所得的差異代謝物為過敏煎含藥血清與加味過敏煎含藥血清的差異性代謝物。將樣本中正、負離子模式所得到的數據合并分析后，一共篩選出差異代謝物173 個（圖4）。其中，屬于生物堿類代謝物的22 個，屬于芳香族化合物類代謝物的4 個，屬于苯丙素類代謝物的31 個，屬于黃酮類代謝物的26 個，屬于醌類代謝物的3 個，屬于氨基酸衍生物類代謝物的2 個，屬于酚類代謝物的6 個，屬于脂質類代謝物的2 個，屬于脂肪酰類代謝物的2 個，屬于脂肪酸類代謝物的1 個，屬于萜類代謝物的26 個。和過敏煎含藥血清相比，有86 個上調和87 個下調代謝物存在于加味過敏煎含藥血清中。通過人類代謝組數據庫檢索這173 個差異代謝物，從而獲取生物學特性數據，并呈現前20 位差異倍數的代謝物（表1）。

圖4 過敏煎和加味過敏煎的差異代謝物火山圖

2.4 代謝通路分析

將鑒定出來的173 個差異代謝物提交至MetaboAnalyst 5.0 進行通路分析，將過敏煎含藥血清與加味過敏煎含藥血清樣本中顯著性的差異代謝物注釋到10條代謝通路中（表2、圖5）。圖中橫軸表示通路的拓撲分析，縱軸表示通路的富集分析（P），節點顏色越深表示P值越小，節點半徑越大表示impact越大。根據P＜0.05且impact＞0，最后共篩選出2條通路：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路以及維生素B6 的代謝通路。酪氨酸為富集在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路上的差異氨基酸，吡哆醇為富集在維生素B6代謝通路上的差異生物堿（表3）。

表2 差異性代謝物涉及的代謝通路

表3 2 條代謝通路所匹配的差異代謝物

圖5 差異代謝物的相關代謝通路

3 討論

過敏煎由防風、烏梅、五味子、銀柴胡、甘草組成。防風辛溫，解表散風勝濕強，善行皮毛與經脈之氣；烏梅酸收性平，既可收斂肺氣，亦可溫養肌膚；銀柴胡味甘辛涼，疏風散邪，清邪壅郁熱，透熱涼血；五味子酸甘而溫，益氣斂肺，補腎養陰。藥理學研究[8]表明，防風、烏梅、五味子、銀柴胡4 味單藥均具有抗過敏的作用[7]；甘草性平，一可補脾益氣，二能調和諸藥。五味藥共奏祛風解表，扶正祛邪之功。加味過敏煎在過敏煎的基礎上增加了白鮮皮、蟬蛻，白鮮皮為蕓香科植物白鮮的干燥根皮，能夠清熱解毒、祛風除濕止癢，藥理學研究[9]表明其有抗菌、抗炎與抗變態反應等作用。蟬蛻是蟬科昆蟲蚱蟬羽化時蛻下的殼，其體輕浮，善走皮腠，可疏散風熱、透疹、祛風止痙、治癮疹，藥理研究[10]表明，蟬蛻具有抗驚厥、抗炎、免疫抑制及抗過敏等作用。二者均為動植物的皮部藥，二皮共用意在“以皮治皮”，增強祛風止癢之效。加味過敏煎的7 味藥共奏祛風止癢除濕、養陰潤燥生津之功。

本實驗基于非靶代謝組學技術分析大鼠灌胃過敏煎、加味過敏煎復方后，其血清中代謝物的變化，采用PCA、OPLS-DA、聚類分析等方法識別大鼠血清樣本數據變化模式。根據PCA和OPLS-DA結果可知，不同處理樣本點分布明顯分離，表明過敏煎和加味過敏煎含藥血清中的代謝物存在明顯差異。根據FC＞1.2 或＜0.83，VIP＞1 且P＜0.05 為篩選標準篩選出差異代謝物173個，將這173個差異代謝物用MetaboAnalyst 5.0進行通路富集分析，分析結果顯示，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成與維生素B6代謝這兩條通路可作為加味過敏煎治療效果區別于過敏煎的主要代謝通路，酪氨酸、吡哆醇分別為這兩條通路所匹配的代謝物。

酪氨酸為氨基酸的衍生物，其與苯丙氨酸、色氨酸一同屬于芳香族氨基酸。芳香族氨基酸是人體內許多重要生物化合物的前體，其中，酪氨酸與神經元的傳遞關系密切，是一種神經遞質前體[11]。除了作為神經遞質的前體，酪氨酸還可被專門的蛋白激酶磷酸化[12]。酪氨酸磷酸化是調節酶活性和信號轉導的主要步驟。研究[13]指出，酪氨酸和FcεRIβ之間的相互作用對于肥大細胞活化至關重要；研究[14]提出，酪氨酸與小鼠模型中嚴重的過敏性哮喘有關，并且是高表達的血液嗜酸性粒細胞的關鍵分子；而研究[15]提出，酪氨酸的微生物代謝可防止氣道過敏性炎癥。以上研究說明酪氨酸對信號通路可能具有雙向調節作用。

映射在維生素B6 代謝通路上的差異代謝物有1 個，即吡哆醇。吡哆醇是具有維生素B6 作用的物質之一，在維持表皮功能方面起著重要作用，目前多用于治療痤瘡和皮膚粗糙。特應性皮炎與角質形成細胞的異常相關，角質形成細胞的異常可使絲聚蛋白的表達下降，進而影響表皮的分化、角化、破壞皮膚屏障功能，促進特應性皮炎的產生[16]。調節絲聚蛋白的表達被認為是治療和預防特應性皮炎的一種前瞻性策略。研究[17]發現，吡哆醇可增加正常人表皮角質形成細胞中絲聚蛋白的表達和產生，這表明吡哆醇是一種有益的化合物，有利于防止特應性皮炎的惡化和復發。

綜上所述，本研究從過敏煎、加味過敏煎的含藥血清中發現酪氨酸和吡哆醇2 個差異代謝物。結合課題組的前期研究分析，加味過敏煎在臨床改善瘙癢癥狀等方面、在動物實驗中改善特應性皮炎小鼠模型瘙癢、皮損等方面作用明顯優于過敏煎，可能與差異代謝物酪氨酸和吡哆醇有關，具體機制還需進一步實驗驗證。