響應面法優(yōu)化鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝

張文霞 康亞男

基金項目：

作者簡介：

張文霞（1984—），女，漢族，本科，主管中藥師，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎。E-mail：zmtg2018@yeah.net

通信作者：

康亞男（1989—），女，漢族，本科，主管中藥師，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎。E-mail：1962628419@qq.com

【摘? 要】

目的：采用星點設計-響應面法優(yōu)化鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝。方法：建立HPLC測定鞣花酸含量，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（15：85）；檢測波長為254 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為 30 ℃；采用星點設計-響應面法對甲醇濃度、提取時間、液料比3個因素進行考察，優(yōu)選鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝。結果：優(yōu)選所得的鹽覆盆子中鞣花酸提取工藝為甲醇濃度73%、提取時間63 min、液料比60∶1，此條件下鞣花酸含量為0.353%。結論：本試驗優(yōu)選所得的提取工藝高效穩(wěn)定、操作簡易、可用于鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取。

【關鍵詞】

鹽覆盆子；鞣花酸；響應面法；工藝優(yōu)化

【中圖分類號】R284.2??? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）22-0038-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322010

Optimization of Extraction Process of Ellagic Acid from Salt Rubus chingii Hu by Response Surface Methodology

ZHANG Wenxia? KANG Yanan*

Dezhou Lingcheng District Hospital of Traditional Chinese Medicine， Dezhou 253500，China

Abstract：

Objective To optimize the extraction process of ellagic acid from Raspberry salina by central composite design response surface methodology. Methods HPLC was established to determine the content of ellagic acid. The mobile phase was acetonitrile -0.2% phosphoric acid solution （15∶85）; The detection wavelength is 254 nm， the flow rate is 1.0 mL·min-1， and the column temperature is 30 ℃; Three factors， methanol concentration， extraction time and liquid to material ratio， were investigated by central composite design response surface methodology to optimize the extraction process of ellagic acid， an effective component of salt raspberry. Results The optimum extraction process of ellagic acid from salt raspberry is that the concentration of methanol is 73%， the extraction time is 63 min， and the ratio of liquid to material is 60∶1. Under this condition， the content of ellagic acid is 0.353%. Conclusion The optimized extraction process is efficient， stable and easy to operate. It can be used for the extraction of ellagic acid， an effective component of raspberry salt.

Keywords：

Salt Rubus chingii Hu; Ellagic Acid; Response Surface Method; Process Optimization

覆盆子又名樹倭泡、樹莓、掌葉覆盆子，為薔薇科植物華東覆盆子（Rubus chingii Hu）的干燥果實［1］，一般在夏初果實由綠變綠黃時采收。覆盆子收載于2020版《中國藥典》，味甘、酸，性溫，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目功效，主要防治陽痿早泄、遺尿尿頻、遺精滑精、目暗昏花［2］。覆盆子含有黃酮、酚酸、萜類等成分［3-4］，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫力等作用［5-7］，其藥用既有生品，也有鹽制品。據(jù)報道［8-9］，鞣花酸具有改善腎小管損傷及腎纖維化活性作用，覆盆子鹽炙后補腎固澀作用顯著增強，可能與鹽炙后鞣花酸含量顯著升高有關。目前，對鹽炙品中鞣花酸的提取工藝研究還未見報道，本實驗以鞣花酸的含量為評價指標，采用星點設計-響應面法優(yōu)化鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝，以期為鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取提供依據(jù)。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? LC-2030C3D Plus高效液相色譜儀（島津公司）；Agilent Extend C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）（安捷倫科技有限公司）；DF110電子天平（佑科儀器儀表公司）。

1.2? 材料? 鞣花酸（批號：111959-201708）購自中國藥品生物制品檢定所；覆盆子購于江西（批號20200426），經(jīng)本院藥劑科康亞男主管藥師鑒定為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingii Hu的干燥果實。

2? 方法與結果

2.1? 鹽覆盆子中鞣花酸的含量測定

2.1.1? 對照品溶液制備? 精密稱取鞣花酸對照品10.50 mg，置50 mL容量瓶中，加73%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為0.21 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.2? 供試品溶液制備? 精密稱定鹽覆盆子粉末（過四號篩）1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入73%甲醇60 mL，稱定重量，回流提取63 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3? 色譜條件? 采用Agilent Extend C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）色譜柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液（15：85）為流動相；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量10 μL。色譜圖如圖1。

2.2? 方法學考察

2.2.1? 線性關系? 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、10.0 mL置10 mL的容量瓶中，加入73%甲醇定容至刻度。按“2.1.3”項下色譜條件測定分析，以峰面積Y對進樣濃度X計算回歸方程，得回歸方程Y=2.436X+0.023（r=0.9996），表明在質(zhì)量濃度0.0021～0.21 mg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關系。

2.2.2? 精密度試驗? 取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件分析，連續(xù)進樣測定6次。結果鞣花酸峰面積RSD為1.41%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3? 穩(wěn)定性試驗? 取鹽覆盆子供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h內(nèi)進樣分析，結果鞣花酸峰面積RSD為1.83%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4? 重復性試驗? 取鹽覆盆子，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定。結果鞣花酸平均含量為0.349%，RSD為0.69%，表明所建立的方法重復性好。

2.2.5? 加樣回收率試驗? 取鹽覆盆子0.5 g，平行6份，按照1∶1的比例加入鞣花酸對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析并計算回收率。結果鞣花酸平均加樣回收率為101.24%，RSD為1.68%。

2.3? 響應面法優(yōu)化鞣花酸提取工藝

2.3.1? 單因素考察? 以鞣花酸含量為評價指標，分別對甲醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%）、提取時間（30 min、45 min、60 min、75 min、90 min）、液料比（10∶1、25∶1、50∶1、75∶1、100∶1）進行考察。結果見圖2，由圖2可知，以70%的甲醇、回流提取60 min，50∶1液料比提取效果最佳。

2.3.2? 響應面設計? 在單因素試驗的基礎上，選擇甲醇濃度、提取時間、液料比為考察因素，利用Box-Behnken軟件設計鞣花酸的提取條件，實驗設計方案和結果見表1和表2。

2.3.3? 方差分析? 方程回歸分析及方差分析結果見表3。鞣花酸含量對甲醇濃度、提取時間、液料比的回歸方程為：Y=0.35+0.008A+0.009B+0.031C+0.004AB+0.016AC-0.014BC-0.028A2-0.008B2-0.023C2。結果顯示，在設定的區(qū)域內(nèi)，所建立的模型達到極顯著水平（P<0.0001），其中二次項中A2和C2的P值均達到了極顯著水平（P<0.01），表明方程擬合較好。

2.3.4? 響應面分析? 應用 Design-Expert 9.0.4 軟件繪制出所考察指標與影響較顯著的3個自變量的等高線圖，具體如圖3所示。結果最佳提取工藝為：甲醇濃度73.32%、提取時間62.87 min、液料比58.76∶1，預測鞣花酸含量為0.355%。

2.2.5? 試驗驗證? 考慮到實際操作的方便可行性，將條件修正為：甲醇濃度73%、提取時間63 min、液料比60∶1，此條件下鞣花酸含量為0.353%，與預測值無顯著差異，表明方程與實際情況擬合良好。

3? 討論

3.1? 目標成分的選擇? 研究顯示，鞣花酸藥理作用廣泛，既有抗炎、抗氧化、抑制細菌生長等活性，還具有改善腎小管損傷及腎纖維化作用，是覆盆子鹽炙后補腎固澀作用增強的主要相關活性成分［8-9］。因此，本試驗選擇鞣花酸為目標成分進行工藝優(yōu)化。

3.2? 優(yōu)化方法的選擇? 響應面法是一種通過回歸方程來擬合各因素水平與響應值之間的函數(shù)關系，可精準預測任一條件組合下的響應值并直觀地看出函數(shù)關系的優(yōu)點，被廣泛用于中藥有效成分的提取工藝優(yōu)化［10］。因此，本試驗選擇響應面法優(yōu)選鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝。

3.3? 流動相的選擇? 本試驗考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-酸水、甲醇-酸水等不同液相條件，結果顯示，以乙腈-0.2%磷酸水為流動相時，鞣花酸的峰形及分離度最好，這可能和鞣花酸是多酚二內(nèi)酯結構有關，加入酸水可抑制其水解，從而改善峰形、增加分離度。

綜上，鞣花酸是覆盆子鹽制后補腎固澀作用增強的主要活性化合物。本實驗優(yōu)化所得的鹽覆盆子中鞣花酸最佳提取工藝為：甲醇濃度73%、提取時間63 min、液料比60∶1，此條件下鞣花酸含量為0.353%，所建立的方法可為鹽覆盆子有效成分的提取工藝研究和質(zhì)量標準完善提供依據(jù)。

參考文獻

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（收稿日期：2023-02-22? 編輯：劉? 斌）