山楂葉番石榴葉復(fù)合發(fā)酵飲料的工藝優(yōu)化

于曉慶，周銘懿，郭雪松

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121000）

山楂葉能夠促進(jìn)血液循環(huán)，消除淤血，調(diào)理氣血流通，降低血脂[1]，富含黃酮類、多糖類、三萜類等多種化合物[2]，具有較強(qiáng)的抗氧化和抗自由基活性[3]。番石榴葉是指屬于番石榴科植物在干燥狀態(tài)下的葉子或者帶有葉子的新鮮莖。在一些國家，番石榴葉具有傳統(tǒng)民間醫(yī)藥用途，可治療多種常見疾病，如風(fēng)濕病、腹瀉、糖尿病和咳嗽等。多項(xiàng)研究顯示，番石榴葉具有對抗糖尿病的活性成分[4]。

植物乳桿菌具有較高的活菌數(shù)量，可以大量產(chǎn)酸，從而最大程度縮短發(fā)酵周期[5]，且由于耐酸性好，大部分菌種在胃液、膽汁內(nèi)可以存活并發(fā)揮功效，因此在制作復(fù)合發(fā)酵飲料時(shí)選擇更為適合的植物乳桿菌作為發(fā)酵劑。山楂葉和番石榴葉經(jīng)過植物乳酸桿菌發(fā)酵研制復(fù)合發(fā)酵飲料，為山楂葉和番石榴葉的精細(xì)加工和全面利用提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂葉、番石榴葉（干葉，亳州市益壽山藥業(yè)有限公司）；白砂糖（食品級(jí)，南京甘汁園股份有限公司）；海藻酸鈉（食品級(jí)，青島明月海藻集團(tuán)有限公司）；植物乳酸桿菌（上海微生物保藏中心）。

乳酸菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海喆鈦機(jī)械制造）；FW-100型高速萬能粉碎機(jī)（東莞市房太電器有限公司）；M4-AL204型電子分析天平（北京天星科儀科技有限公司）；OSP-520E型超聲波清洗機(jī)（石家莊奧斯派機(jī)械科技有限公司）；DE-52CS型離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；YX-280B型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；CJ-840型水平超凈工作臺(tái)（東莞市弘維凈化科技有限公司）；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱（上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；RM-755B型紫外分光光度計(jì)（青島瑞明儀器設(shè)備有限公司）；YY-400型pH計(jì)（上海三信儀表廠）；GJJ-0.06/100型均質(zhì)機(jī)（東方化玻科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程原料葉→清洗去雜→烘干→粉碎→浸提→離心→接種→發(fā)酵→配料→均質(zhì)→成品

1.3.2 浸提液的制備

選擇表面整潔、無霉變和蟲蛀的山楂葉和番石榴葉，用清水沖洗3遍除去其表面的雜質(zhì)，在80 ℃烘箱中烘干。將烘干后的山楂葉和番石榴葉用粉碎機(jī)粉碎成粉末狀，過0.425 mm（40目）篩，分別以料水比1∶20（g/mL），在70 ℃條件下進(jìn)行超聲波輔助浸提60 min。浸提液經(jīng)離心后取上清液，備用。

1.3.3 菌種的活化

植物乳桿菌的活化及擴(kuò)大培養(yǎng)：配制100 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基，在121 ℃下滅菌15 min后冷卻至40℃左右；將甘油保存的植物乳桿菌在超凈工作臺(tái)上轉(zhuǎn)移到MRS肉湯培養(yǎng)基中，并且放置在恒溫培養(yǎng)箱中以37±1 ℃的溫度培養(yǎng)48 h；將3 mL培養(yǎng)液取出后，轉(zhuǎn)移到新的MRS肉湯培養(yǎng)基中，并將其放置在恒溫培養(yǎng)箱中（溫度37±1 ℃）進(jìn)行48 h培養(yǎng)，得到活化2次的植物乳桿菌懸液，備用。

1.3.4 山楂葉番石榴葉復(fù)合發(fā)酵飲料的制備

將活化后的植物乳桿菌懸液加入浸提液中并充分?jǐn)嚢杌旌虾蠓湃牒銣嘏囵B(yǎng)箱中進(jìn)行一段時(shí)間的發(fā)酵，完成發(fā)酵后，以總浸提液的體積為基數(shù)加入5%白砂糖、0.25%海藻酸鈉，進(jìn)行2次25 MPa的均質(zhì)處理后得到成品。

1.3.5 植物乳桿菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)

在乳酸菌發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵液中乳酸菌不斷繁殖，乳酸菌數(shù)量逐漸增多，根據(jù)白長勝等[6]運(yùn)用吸光度法快速進(jìn)行乳酸菌活菌計(jì)數(shù)的研究，乳酸菌發(fā)酵液在600 nm波長下測得的吸光度能反映乳酸菌發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)的數(shù)量，因此單因素試驗(yàn)以A600（發(fā)酵液在600 nm波長下測得的吸光度）為指標(biāo)考察發(fā)酵條件。單因素試驗(yàn)條件設(shè)置：以發(fā)酵后飲料的A600為評(píng)價(jià)指標(biāo)，固定接種量4%、發(fā)酵時(shí)間36 h，設(shè)置發(fā)酵溫度31，33，35，37和39 ℃，探究發(fā)酵溫度對飲料A600的影響；固定發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間36 h，設(shè)定植物乳桿菌的接種量2%，3%，4%，5%和6%，探究接種量對飲料A600的影響；固定乳桿菌接種量4%、發(fā)酵溫度37 ℃，將原料浸提液分別發(fā)酵36，40，44，48和52 h，探究發(fā)酵時(shí)間對飲料A600的影響。

1.3.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化

基于單因素試驗(yàn)，根據(jù)發(fā)酵液的A600，使用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.3.7 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)檢測

1.3.71 pH的測定

采用pH計(jì)測量復(fù)合發(fā)酵飲料的pH。

1.3.72 總酸的測定

根據(jù)GB 12456—2021《食品中總酸的測定》[7]測定飲料總酸。

1.3.73 可溶性蛋白含量的測定

根據(jù)可溶性蛋白試劑盒使用說明，使用雙縮脲法測定飲料中可溶性蛋白含量。

1.3.74 微生物指標(biāo)測定

乳酸菌活菌數(shù)的測定，根據(jù) GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[8]進(jìn)行乳酸菌的測定；根據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)的測定》[9]方法，對飲料中乳酸菌活菌數(shù)進(jìn)行測定；大腸菌群的測定，根據(jù)GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》[10]測定飲料大腸菌群；霉菌和酵母菌測定，根據(jù)GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)》[11]測定飲料霉菌和酵母菌。

1.3.8 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)采用百分制的評(píng)分方法，請15位品評(píng)人員參照表2的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對制作的復(fù)合發(fā)酵飲料進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括組織狀態(tài)、口感、氣味和整體接受度4個(gè)方面，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用無記名打分方式。

表2 復(fù)合發(fā)酵飲料的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

各試驗(yàn)平行重復(fù)3次，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”的形式描述試驗(yàn)結(jié)果。以P＜0.05計(jì)為統(tǒng)計(jì)具有顯著性差異，P＜0.01計(jì)為統(tǒng)計(jì)差異極顯著。用Design-Expert 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵最佳工藝參數(shù)

2.1.1 接種量對復(fù)合發(fā)酵飲料A600的影響

如圖1所示，A600隨著接種量的增加而增加。接種量超過5%后，A600沒有明顯變化。這是由于植物乳酸桿菌不斷繁殖，導(dǎo)致乳酸產(chǎn)量增加，發(fā)酵液的pH下降，從而抑制乳桿菌的生長。因此，選取接種量較低、A600較高的發(fā)酵條件，即選擇5%作為適宜的接種量。

圖1 接種量對A600的影響

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對復(fù)合發(fā)酵飲料A600的影響

從圖2可以觀察到，復(fù)合發(fā)酵飲料的A600隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而增加，發(fā)酵時(shí)間44 h后，A600的增加量逐漸趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)橹参锶闂U菌利用原料中的碳水化合物不斷產(chǎn)酸，不斷提高的酸度及其代謝產(chǎn)物對植物乳桿菌的生長起到抑制作用，降低其繁殖速度。初步考慮，發(fā)酵時(shí)間約44 h。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對A600的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對復(fù)合發(fā)酵飲料A600的影響

由圖3可得，發(fā)酵溫度過低或過高均會(huì)抑制植物乳桿菌的生長，發(fā)酵溫度保持在35 ℃時(shí)，復(fù)合發(fā)酵飲料的A600達(dá)到最高值，同時(shí)飲料中的活菌數(shù)也達(dá)到最高水平，因此，選擇發(fā)酵溫度35 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對A600的影響

2.2 發(fā)酵工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)，在復(fù)合發(fā)酵飲料中，以A600作為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，參數(shù)包括接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度。表3展示響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 13.0軟件對表3中的A600進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：A600=0.650 6+0.022 3A+0.019 4B+0.025 6C-0.000 3AB+0.005 8AC+0.004 5BC-0.048 6A2-0.060 3B2-0.122 8C2。

2.2.2 回歸模型有效性及顯著性

對響應(yīng)面模型進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果如表4所示。

表4 回歸模型的方差分析

結(jié)果表明：回歸模型F=712，模型P值＜0.01，說明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P值＞0.05，為不顯著，模型合理。決定因素R2=0.998 9，這說明回歸方程具有良好的擬合性，能有效描述因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系；Radj2=0.997 5，表明試驗(yàn)誤差小，可靠性高。在回歸模型中，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)的顯著性非常高，P值小于0.000 1，對A600均有極顯著影響。通過F值，可以判斷植物乳桿菌發(fā)酵山楂葉番石榴葉復(fù)合飲料A600的結(jié)果受到發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時(shí)間3個(gè)考察因素的影響程度，按照大小順序排列為發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間。

2.2.3 響應(yīng)面因素交互作用分析

在對復(fù)合發(fā)酵飲料A600的影響進(jìn)行綜合考察時(shí)，通過將其中1個(gè)因素保持不變，選擇其他2個(gè)因素觀察它們對A600的影響。通過Design-Expert 13.0軟件對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出等高線圖和響應(yīng)曲面。

從圖4可以觀察出，植物乳桿菌的發(fā)酵參數(shù)呈現(xiàn)為橢圓形等高線圖，揭示接種量和發(fā)酵溫度之間有明顯交互作用，通過增大這2個(gè)因素，觀察到A600呈先升高后下降的趨勢。通過觀察響應(yīng)曲面圖，可以發(fā)現(xiàn)增加發(fā)酵溫度對A600影響更明顯，相比之下增加接種量對A600的影響較小，說明發(fā)酵溫度對A600影響較大。

圖4 接種量和發(fā)酵溫度的響應(yīng)曲面圖（左）和等高線圖（右）

根據(jù)圖5可以觀察到，植物乳桿菌的發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的等高線圖形呈不明顯的橢圓形狀，這表明發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度2個(gè)因素之間的相互影響作用較小。發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度逐漸增加，導(dǎo)致A600先增加后減少，但發(fā)酵溫度的增加幅度顯著高于發(fā)酵時(shí)間，表明發(fā)酵溫度對A600有更大影響。

圖5 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的響應(yīng)曲面圖（左）和等高線圖（右）

從圖6可以看出，植物乳桿菌的發(fā)酵時(shí)間和接種量之間的相互作用不明顯，它們的等高線圖形呈現(xiàn)一個(gè)不明顯的橢圓狀。這表明發(fā)酵時(shí)間和接種量這2個(gè)因素之間的相互影響并不顯著。隨著植物乳桿菌接種量和發(fā)酵時(shí)間的增加，A600的測量值呈現(xiàn)先增加后減少趨勢。通過觀察該響應(yīng)曲面，可以發(fā)現(xiàn)它們的上升幅度相似，即2個(gè)因素對A600的影響程度相當(dāng)。

圖6 接種量和發(fā)酵時(shí)間的響應(yīng)曲面圖（左）和等高線圖（右）

3個(gè)因素之間的相互作用及對A600的影響與方差分析結(jié)果一致，運(yùn)用Design-Expert 13.0軟件得出該數(shù)據(jù)模型的最大值點(diǎn)，即植物乳桿菌發(fā)酵復(fù)合飲料的最佳生產(chǎn)工藝條件為接種量5.235%，發(fā)酵溫度35.225℃，發(fā)酵時(shí)間44.659 h，最大A600為0.656。為方便試驗(yàn)操作，對發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化，即接種量5%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間44 h。通過對優(yōu)化后的試驗(yàn)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測定其A600并得到平均值0.651±0.004。與模型預(yù)測值相比，誤差僅0.76%，這表明試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值的符合程度相當(dāng)良好。因此，Box-Behnken設(shè)計(jì)不僅方案準(zhǔn)確可靠，而且具有可操作性，能夠確保各個(gè)因素的添加量被準(zhǔn)確把握。

2.2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)檢測結(jié)果

根據(jù)1.3.7產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)檢測中方法進(jìn)行檢測，結(jié)果如表5所示。

表5 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)檢測結(jié)果

由表5可知：復(fù)合發(fā)酵飲料中可溶性蛋白質(zhì)含量為0.32±0.01 mg/mL，乳酸菌總數(shù)為1.9±0.2×107CFU/mL，總酸度為0.31±0.03 g/L，大腸桿菌、酵母菌、霉菌數(shù)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2.5 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

由圖7可以看出，15位品評(píng)人員中大部分認(rèn)為該復(fù)合發(fā)酵飲料無異味，酸甜適中，口味純正，風(fēng)味良好，具有山楂葉番石榴葉的清香。

圖7 感官評(píng)分

3 結(jié)論

以植物乳桿菌作為發(fā)酵劑對山楂葉和番石榴葉的浸提液進(jìn)行發(fā)酵以制備復(fù)合飲料，最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量5%、發(fā)酵時(shí)間44 h、發(fā)酵溫度35 ℃，在此條件下制備的發(fā)酵飲料A600為0.651±0.004，得到的復(fù)合發(fā)酵飲料酸甜可口，風(fēng)味良好，大腸桿菌、酵母菌、霉菌數(shù)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。