水產品中獸藥殘留的液相色譜前處理方法的研究進展

李燕瑩，易云婷，戚平，劉冬豪，陳佩儀，毛新武

廣州市食品檢驗所（廣州 510000）

水產品中獸藥殘留主要包括磺胺類、喹諾酮類、硝基呋喃類、糖皮質激素類、氯霉素、三苯甲烷染料、抗生素、殺蟲劑、性激素類、鎮靜劑等化合物。水產品中獸藥殘留的檢驗方法主要包括氣相色譜法[1-2]、液相色譜法[3-4]。常用的檢驗方法為液相色譜法，其前處理方法有固相萃取、QuEChERS、固相微萃取、液-液萃取[5-6]四大類，超聲輔助萃取[7]和微波輔助萃取[8]也有研究用于前處理。

食品安全監督抽檢實施細則中不同水產品類別指定的獸藥殘留檢驗方法不同，不同的方法需要不同的試劑耗材設備，檢驗耗時長且不環保，因此尋找一種通用的檢驗方法顯得尤為重要。文章基于2021—2023年的食品安全監督抽檢實施細則中水產品中獸藥殘留的檢驗方法分析現狀，綜述固相萃取、QuEChERS、固相微萃取這3種水產品中獸藥殘留的液相色譜前處理方法的研究進展。以期為尋找經濟高效、穩定準確的檢驗方法提供思路，展望頒布適用范圍較廣的水產品中獸藥殘留的檢驗方法，經濟高效，減少污染。

1 2021—2023年食品安全監督抽檢實施細則中水產品中獸藥殘留的檢驗方法

參考2021—2023年食品安全監督抽檢實施細則中水產品中獸藥殘留的檢驗方法，分析其指定檢驗方法的變化和適用范圍（表1），并分析不同檢驗方法的適用范圍、液相色譜前處理方法、測試儀器和靈敏度（表2）。

表1 2021—2023年食品安全監督抽檢實施細則中水產品中獸藥殘留的檢驗方法

表2 水產品中獸藥殘留的檢驗方法的適用范圍、液相色譜前處理方法、測試儀器和靈敏度

現行細則中氯霉素檢驗方法GB 31658.2—2021《動物性食品中氯霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》的水產品適用范圍縮小了。對比GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》，兩者的前處理方法原理基本一致，但是使用的試劑種類、順序和量不同。相比之下，GB 31658.2—2021提取步驟避免使用分液漏斗，更加節省試劑，減少操作時間。對比GB/T 20756—2006《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》，GB 31658.2—2021使用乙腈輔助提取，避免只用乙酸乙酯萃取過多脂類，并在凈化步驟使用C18SPE，去脂效果更好。

硝基呋喃類檢驗方法GB 31656.13—2021《水產品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》的適用范圍也是縮小了。另外，貝類的指定方法在3年間兩度變更。對比農業部783號公告-1-2006《水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》和農業部781號公告-4-2006《動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 高效液相色譜-串聯質譜法》，兩者的前處理方法原理基本一致，后者需要先洗滌再衍生和提取，減少干擾，前者無需洗滌，經濟高效。對比農業部783號公告-1-2006和GB 31656.13—2021，兩者的前處理方法原理和步驟基本一致，只有用乙酸乙酯4 mL提取2次和8 mL提取1次，以及濾膜規格的區別，但是檢驗方法適用范圍不同。

磺胺類和喹諾酮類檢驗方法均為農業部1077號公告-1-2008《水產品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》，同一檢驗方法可以測定2種化合物，減少環境污染，經濟高效。另外，這個方法適用范圍涵蓋甲氧芐啶，但是甲氧芐啶檢驗指定另一方法。

GB/T 19857—2005《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》中液相色譜-質譜法的靈敏度更佳，與GB/T 20361—2006《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法》檢出限一致，但熒光檢測法抗干擾能力明顯不如液相色譜-質譜法。所以，從2022年開始孔雀石綠指定使用GB/T 19857—2005檢驗。

在我國植物源性食品的農藥殘留測試中，已頒布適用范圍較廣的GB 23200.113—2018《植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯用法》及GB 23200.121—2021《植物源性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯用法》。這2個方法涵蓋大多數的基質，并對基質進行分類，不同類別基質使用不同的前處理方法，提高檢驗效率。在水產品中獸藥殘留檢驗中，SN/T 3235—2012《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》也將基質分為牛奶、動物肌肉、肝臟、水產品4大類，并且前處理使用QuEChERs，有發展應用的潛力。

繁復的前處理方法增加經濟負擔，多消耗的試劑耗材污染環境。所以尋找一套高效通用的前處理方法非常必要。對近幾年水產品中獸藥殘留液相色譜的前沿前處理方法進行綜述，為開發新方法提供思路，展望水產品中獸藥殘留檢驗也能夠有適用范圍較廣的前處理方法頒布，減少消耗，經濟高效。

2 水產品中獸藥殘留的液相色譜前處理方法的研究進展

2.1 固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）用于水產品中獸藥殘留的液相色譜前處理

SPE自1951年被報道以來[9]，已成為常用的前處理方法，通過吸附材料的選擇可以富集不同的化合物，現在大部分SPE吸附材料可富集微克級待測物，并有很好的回收率[10]。錢振杰等[11]通過將SPE用于水產品中獸藥殘留的液相色譜前處理的研究，測定6種丁香酚類化合物殘留量，定量限低至0.02 mg/kg，方法簡單靈敏。

常規SPE需要活化凈化小柱、洗脫、富集，耗時較長。快速濾過型凈化（multi-plug filtration cleanup，m-PFC）柱填料主要是C18、PSA、多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT），不用活化凈化小柱。王強等[12]使用m-PFC測試牛蛙中50種獸藥殘留，檢出限為0.5～1.0 μg/kg，回收率為79.4%～112.1%。并且分析EMR-Lipid、m-PFC、PRiME HLB這3種SPE柱的差異，結果發現m-PFC效果最好。m-PFC柱含有MWCNT，可以凈化部分色素，使回收率更好。近年來，在線SPE取得重大進展，實現在線凈化基質，減輕人力作業并提高效率。歐陽少倫等[13]使用在線SPE凈化水產品，進行123種獸藥殘留的測試，檢測低限可達0.1～50 μg/kg。另外，許多SPE的分支體系有新的研究進展。

2.1.1 分散固相萃取（dispersed Solid Phase Extraction，dSPE）

dSPE是直接將吸附材料加入樣品基質溶液中，吸附基質干擾或選擇性吸附待測物。從傳質角度看，dSPE可以增加基質和吸附材料的接觸面積，操作過程比常規SPE快，提取效率高[14]。

MWCNT為大共軛結構，可以提供分子間形成氫鍵和π鍵，對帶共軛結構的分子，即胺類、醇類、酚類都有很好的富集凈化效果，是一種潛力很大的dSPE吸附材料，近年來備受關注[15]。石墨化MWCNT是MWCNT衍生產物，其表現出超MWCNT的卓越性能，被用于水產品中獸藥殘留的前處理[16]。Huang等[1]使用石墨化MWCNT輔助的dSPE方法分析50種魚類樣本中的麻醉劑和鎮靜劑殘留，檢出限為0.03～0.4 μg/kg，回收率為86.3%～111.7%。Phomai等[17]使用鞣酸、含有Fe3+的溶液、緩沖液和樣品直接“一鍋法”反應，原位生成鞣酸與Fe3O4的螯合配體化合物作為吸附材料，檢驗動物樣本中的四環素藥物，檢出限為1.06～3.19 ng/mL，回收率為79.3%～107.1%。該方法不需要準備固體吸附材料，思路新穎。

2.1.2 磁固相萃取（magnetic solid phase extraction，MSPE）

dSPE需要經過離心和過濾回收吸附材料，而MSPE只需磁鐵吸附即可收集吸附材料，非常高效[18-19]。MSPE的核心在于制備磁性納米微球。許多金屬可作為磁性納米微球骨架，如鐵、鈷、鎳、Fe3O4、γ-Fe2O3。其中，Fe3O4應用最為廣泛，其具有易于制備、易于表面改性、磁性強等優點。對磁性納米微球骨架進行表面改性，就能得到不同性能的吸附材料，如：用C18修飾磁性納米微球，利用C18官能團疏水性，對疏水性物質的分離富集有良好表現；用高分子修飾可以讓磁性納米微球生物相容性變好，改善容易氧化和穩定性差等缺陷；選擇不同高分子的官能團，對于不同化合物有選擇性富集的效果。

Li等[4]通過限進介質固相萃取吸附材料——牛血清白蛋白限制-十八烷基/苯基混合功能化磁性二氧化硅納米顆粒（BSA-C18/Ph-Fe3O4@SiO2NP）富集12種水產品中的舍曲林和苯海拉明，液相色譜-質譜法檢出限低至0.018 μg/kg，回收率為91.6%～103.6%。牛血清白蛋白可以阻止大分子（主要是蛋白質）吸附，允許小分子通過并被內部材料吸附。其機理是限進介質的蛋白質排斥機制（通過基于親水基團組成的網格，或通過尺寸排阻構建的物理屏障）。Liu等[20]通過二乙烯基苯、N-乙烯基吡咯烷酮和Fe3O4制備磁性納米微球Fe3O4@SiO2@DVB-NVP（Poly-MDN），接著使用優化配比的Poly-MDN、C18、石墨化碳黑（GCB）作為凈化劑進行基質凈化，對24種水產品進行112種獸藥殘留的測試，檢出限為0.1～2.0 μg/kg。這一方法材料制備簡單，測試范圍廣泛，有很大的應用前景。Shen等[21]通過制備磁性共價有機框架/氧化石墨烯復合材料測試鯉魚、黃花魚和蝦中的奧司他韋，檢出限為0.035 μg/kg，回收率為87%～116%。該方法結合氧化石墨烯、共價有機框架材料及MSPE，氧化石墨烯在有機物提取富集中有著巨大優勢[22]，而共價有機框架材料有巨大的比較面積和易于改性[23]，二者與MSPE結合勢必會有很多新應用。

2.1.3 分子印跡聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）萃取

常規SPE主要依靠C18等材料基于非特異性疏水作用進行萃取，會導致很多干擾化合物的共萃。分子印跡技術通過合成方法制備具有特定分子識別的功能化材料，可作為某一類化合物的專用吸附材料[24]。Wang等[25]使用α-氯DDT（三氯殺螨醇的結構類似物之一）作為虛擬模板，通過水懸浮液合成MIP微球，使用甲基丙烯酸、乙二醇二甲基雙丙烯酸酯和聚乙烯吡咯烷酮作為單體的聚合、交聯劑和分散劑制備了對于三氯殺螨醇具有高選擇性的MIP微球，測試6種水產品中的三氯殺螨醇殘留量，檢出限為0.1 ng/g，回收率為85.8%～101.2%。

2.2 QuEChERS用于水產品中獸藥殘留的液相色譜前處理

QuEChERS結合樣品預處理和dSPE兩個過程，是由dSPE商品化規模化而來，自2003年報道以來[26]，被廣泛應用于樣品前處理。通過對萃取溶液或萃取粉包的選擇，可將不穩定分析物的降解影響降低，同時保證較好的萃取凈化效果及回收率[15]。QuEChERS與傳統的提取技術相比，有樣品和溶劑消耗更少、樣品制備時間更短的優點。

Gan等[2]使用常規QuEChERS進行水產品中的6種二酰肼測試，并且研究凈化步驟中GCB和C18對于水產品的影響。研究發現PSA/C18結合用于凈化水產品效果較好，回收率可達90.5%～95.8%，而PSA/GCB結合對水體沉積物的凈化效果更好。Kim等[27]研究水產品測試中的提取溶液及水的影響。通過32種農藥和20種藥品的測試，結果發現：10 mL蒸餾水和10 mL添加1%富馬酸的乙腈提取效果最好；萃取層下方的水層可以富集大量的水溶性基質，減少萃取層的共萃物，減少基質效應。另外，水的加入可讓萃取層清澈，便于液相色譜-質譜分析。

QuEChERS在萃取溶劑、凈化粉包選擇上都有很多注意事項。萃取溶劑一般選擇乙腈，因為加入NaCl可以很好地鹽析分層，共萃物較少。另外，乙酸乙酯和丙酮也是不錯的溶劑。單試劑使用乙酸乙酯會有較多脂肪類分子共萃，如果待測物質是非極性化合物為主，可以考慮使用乙酸乙酯萃取。丙酮則是水相溶性更佳，能萃取很多極性分子，特定應用也可以考慮。凈化粉包方面，PSA主要去除有機酸、糖類、脂類，C18主要去除脂類和固醇，GCB主要去除色素（但是也會吸附平面結構的物質）。如果測試聯苯類平面結構物質，在凈化步驟可以加入一些甲苯。在低pH基質中，加入醋酸緩沖鹽對于堿性化合物的回收率會更好。而對于脂肪含量較高的基質，凈化步驟加入EMR lipid這類新型的脂肪吸附材料再反萃，回收率會更好。

2.3 固相微萃取（Solid Phase microextraction，SPME）用于水產品中獸藥殘留的液相色譜前處理

SPME將3個關鍵前處理步驟（取樣、提取和預濃縮）合并為一個步驟，操作非常方便[28]，是很好的分析生物基質方法。SPME還可以實現活體取樣，這是其他前處理方法無法比擬的。

Tang等[29]使用定制的生物相容性C18-PAN纖維頭（45 μm）萃取河豚體內的氟喹諾酮藥物，取樣點為活體河豚背側近軸肌肉，纖維內SRSD為11.2%～14.3%（n=6），纖維間SRSD為13.1%～16.1%（n=5），檢出限可低至0.3 ng/g。Mondal等[30]使用金屬-有機框架材料MIL-101(Cr)-NH2修飾SPME纖維頭，在活體羅非魚體內測試6種抗生素。使用水熱法，通過硝酸鉻水合物、2-氨基對苯二甲酸制備MIL-101(Cr)-NH2顆粒，將金屬-有機框架材料涂布于石英纖維頭上，纖維頭用于提取魚背中軸的肌肉中抗生素，檢出限可低至0.18～1.12 ng/g，并且方法重現性好，纖維內SRSD為1.5%～8.3%，纖維間SRSD為7.3%～14.5%。使用容易形成分子間氫鍵的纖維，大部分抗生素都有比較多容易形成分子間氫鍵的位點。該方法有望拓展應用于更多的獸藥殘留測試中。

3 結語和展望

分析現行細則中水產品獸藥殘留檢驗方法，有的檢驗方法是8年前的標準，雖說方法經典好用，但是隨著技術進步，應加快推進食品安全標準的更新迭代，將更加高效準確的方法納入細則中。另外，許多檢驗方法原理和步驟基本一致，只是涵蓋的化合物或基質不同。可能是沒有擴大做更多化合物或更多基質的方法驗證的原因。希望未來通過擴大食品安全標準的適用范圍，同一檢驗方法可以測試更多基質和化合物，提高經濟效率和減少環境污染。

成熟的大規模檢驗方法需要操作簡單、測試速度快、經濟、結果準確這幾個關鍵因素。綜合上述研究進展，參考農藥殘留已經在大力推廣QuEChERS方法，把待測物基質分類，對應使用不同方法包，QuEChERS更有潛力成為通用的水產品中獸藥殘留前處理方法。但是QuEChERS也有其局限性，所以對于某種特定基質或者化合物需要單獨的前處理方法作為補充。盡管如此，也能大大減少實驗室的設備及耗材，做到經濟高效環保。